СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1994 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения биомассы микроорганизмов.

Известны способы получения биомассы микроорганизмов путем их культивирования в жидких питательных средах, состоящих из растворов питательных веществ в воде.

Основными недостатками таких способов является низкая скорость роста, невысокая урожайность питательных сред, интенсивное пенообразование, а также низкая устойчивость получаемых микробных клеток к основным технологическим процессам их переработки при получении готовых форм биопрепаратов - замораживанию и высушиванию при лиофилизации, аэрозолированию и высушиванию при распылительной сушке.

Известны способы культивирования микроорганизмов в питательных средах с дополнительным введением в них аминокислот, витаминов или мелассы, обеспечивающие повышение устойчивости микроорганизмов к высушиванию на 20-30%.

Основными недостатками этих способов являются интенсивное пенообразование и низкий уровень повышения устойчивости микроорганизмов при высушивании.

Прототипом изобретения является способ получения биомассы микроорганизмов, обеспечивающий повышение устойчивости бактериальных клеток к замораживанию путем введения в питательную среду поверхностно-активного вещества твина-80. Указанный способ обеспечивает повышение устойчивости лактобацилл к замораживанию и кратковременному (48 ч) хранению в условиях температуры минус 17^оС (сохранение активности - 40-60%).

Основными недостатками способа являются обильное пенообразование и необходимость использования пеногасителей, низкий уровень повышения устойчивости бактерий к замораживанию и одинаковый с контрольным способом (без твина) выход биомассы микроорганизмов после культивирования.

Целью изобретения является увеличение скорости роста и выхода получаемой биомассы микроорганизмов, повышение устойчивости к стрессовым факторам - замораживанию, высушиванию и аэрозолированию.

Цель достигается введением в питательные среды, используемые для культивирования различных микроорганизмов 12,5-50% (объем-объем) 0,1-5% (объем/объем) раствора этерифицированного полиглицерина в масле. В результате использования предлагаемого способа достигается увеличение более чем в 2 раза скорости роста и выхода получаемой биомассы, повышение устойчивости микроорганизмов к замораживанию, высушиванию и аэрозолированию, устранение пенообразования. Дополнительно происходит удешевление процесса в целом за счет более низкой стоимости раствора этерифицированного полиглицерина в неполярном растворителе по отношению к питательной среде.

Существенным отличием заявляемого способа является использование для культивирования микроорганизмов принципиально другого механизма взаимодействия поверхностно-активного вещества с растущими клетками. Благодаря введению раствора этерифицированного полиглицерина в неполярном растворителе в процессе культивирования формируется эмульсия питательной среды в неполярном растворителе, что приводит к интенсификации процессов массообмена, увеличению скорости роста, количества и качества получаемой биомассы.

П р и м е р 1. Приготовили стандартную жидкую питательную среду для культивирования E. coli M=17 - продуцента колибактерина. В питательную среду внесли посевную культуру из расчета 1 млрд. кл на 1 мл среды. Культивирование проводили в колбах на качалке при температуре 37±2^оС. Урожай биомассы в указанных условиях культивирования составил 4,2±0,5 млрд. живых клеток в 1 мл питательной среды, удельная скорость роста - 0,35-0,37 и время удвоения биомассы 1,87-1,98 ч (табл.1).

П р и м е р 2. Приготовили питательную среду путем добавления к одному объему стандартной среды по условиям примера 1 одного объема 5% (объем/объем) раствора этерифицированного полиглицерина (ЭПГ) в нормальном жидком парафине додекане. Внесли посевную культуру и провели культивирование согласно условиям примера 1. Через 6 ч культивирования урожай биомассы составил 8,8±0,7 млрд. живых клеток в 1 мл среды, удельная скорость роста 0,56-0,58 и время удвоения биомассы 1,03-1,14 (табл.1).

П р и м е р 3. Приготовили питательную среду и провели культивирование согласно условиям примера 2. В качестве масла использовали жидкий парафин - тетрадекан. Через 6 ч культивирования урожай биомассы составил 10,3±1,2 млрд. живых клеток в 1 мл среды, удельная скорость роста 0,66-0,69 и время удвоения биомассы 1,00-1,05 ч (табл.1).

П р и м е р 4. Приготовили питательные среды согласно условиям примеров 2 и 3, но с содержанием ЭПГ в масляной фазе 2,5% (объем/объем). Провели культивирование в условиях примера 3. Выход биомассы через 6 часов культивирования составил 6,1±0,8 млрд.живых клеток в среде с додеканом и 6,2±0,9 в среде с тетрадеканом (табл.1).

П р и м е р 5. Приготовили стандартную питательную среду для культивирования Bac.thuringiensis var. Kurstaki - продуцента лепидоцида. В питательную среду внесли биомассу спор Bac.thuringiensis в концентрации 0,5 млрд. живых спор на 1 мл питательной среды. Культивирование проводили при температуре 37±2^оС в ферментере Ультроферм (ЛКБ, Швеция) в объеме 4 л. Через 24 ч культивирования урожай биомассы составил 2±1 млрд.живых клеток в 1 мл среды. В процессе роста происходило обильное пенообразование, которое устраняли периодическим добавлением полипропиленгликоля (табл.1).

П р и м е р 6. Приготовили питательную среду путем добавления к одному объему стандартной питательной среды по условиям примера 5 одного объема 0,1% раствора (объем/объем) ЭПГ в жидком парафине гексадекане. Внесли посевную культуру и провели культивирование согласно условиям примера 5. Через 18 ч культивирования урожай биомассы Bac. thuringiensis составил 17,7±2,1 млрд. живых клеток в 1 мл среды. В процессе культивирования пенообразования не происходило (табл.1).

П р и м е р 7. Приготовили питательную среду согласно условиям примера 3, но содержанием ЭПГ в масляной фазе 0,05% (объем/объем). Провели культивирование в условиях примера 3. Выход биомассы E.coli через 6 ч культивирования составил 3,8±0,4 млрд.живых клеток в 1 мл питательной среды.

П р и м е р 8. Приготовили питательные среды согласно условиям примеров 2 и 3, но без добавления ЭПГ в масляную фазу. Провели культивирование в условиях примера 3. Через 6 ч культивирования выход биомассы составил 4,0±0,5 млрд/мл живых клеток в среде с додеканом и 4,1±0,5 млрд/мл живых клеток E.coli в среде с тетрадеканом (табл.1).

П р и м е р 9. Приготовили питательную среду согласно условиям примера 3, но с содержанием ЭПГ в масляной фазе 7% (объем/объем). В питательную среду внесли посевную культуру E.coli М-17 из расчета 1 млрд.клеток на 1 мл среды. Культивирование проводили в ферментере "Ультроферм" (ЛКБ, Швеция) при 37^оС в течение 6 ч в объеме 4 л. Через 6 ч культивирования урожай биомассы составил менее 1 млрд/мл живых клеток E.coli (табл.1).

П р и м е р 10. Приготовили питательные среды согласно условиям примера 3, но с добавлением к стандартной питательной среде 5%, 12,5%, 25%, 50% и 75% (объем/объем) 5% (объем/объем) раствора этерифицированного полиглицерина в тетрадекане. В питательные среды внесли посевную культуру и провели культивирование согласно условиям примера 3. Количество биомассы, полученной через 6 ч культивирования в среде с одинаковым содержанием водной и масляной фаз (согласно условиям примера 3) приняли за 100%. Выход биомассы через 6 часов культивирования в средах с 12,5 и 25% масляной фаз был одинаков и составлял соответственно 106±17 и 96±9% по отношению к урожаю в питательной среде с одинаковым содержанием водной и масляной фаз. В питательных средах с 5 и 75% масляной фазы выход биомассы составлял соответственно 52±7% и 40±8% по отношению к урожаю, полученному в питательной среде, изготовленной согласно условиям примера 3 (табл.2).

П р и м е р 11 (по прототипу). Приготовили питательную среду согласно условиям примера 1. В питательную среду внесли 0,1% твина-80. Внесли посевную культуру и провели культивирование согласно условиям примера 1. Через 6 ч культивирования урожай биомассы составил 4,3±0,5 млрд/мл живых клеток E.coli M-17.

П р и м е р 12. Приготовили питательные среды и провели культивирование согласно условиям примеров 1, 2, 3 и 11. Полученные культуры разлили в ампулы и заморозили при температуре минус 10±2^оС. Через 6 мес хранения количество живых клеток в контрольных препаратах составляло 2-7% от исходного количества, в препаратах, выращенных с твином-80 - 6-13%, в препаратах, выращенных с додеканом и ЭПГ- 30-37%, в препаратах, выращенных с тетрадеканом и ЭПГ - 42-60% от исходного количества живых клеток в указанном препарате
П р и м е р 13. Культуры E.сoli вырастили согласно условиям примеров 1 и 3. Препараты высушили в тонком слое в вакууме при комнатной температуре до влажности 4±1%. До и после высушивания определили количество жизнеспособных клеток. Выживаемость клеток E.coli составляла 12-60% в контрольных препаратах и 90-100% в препаратах, выращенных с тетрадеканом.

П р и м е р 14. Культуры E.coli вырастили согласно условиям примеров 1, 2 и 3. Препараты распылили в статическую аэрозольную камеру с относительной влажностью 50±5%. В течение 30 мин витания определяли количество живых клеток в пробах аэрозоля. Выживаемость контрольных образцов через 1,5 и 30 мин витания составляла соответственно 7-15%, 3-5% и 1-3%. Выживаемость препаратов с додеканом и тетрадеканом составляла 27-51, 28-36 и 19-24 % через 1,5 и 30 мин витания.

Данные примеров 1-14 показывают, что предлагаемый способ получения биомассы микроорганизмов обеспечивает увеличение скорости роста и количества биомассы микроорганизмов и одновременно повышение устойчивости выращенных клеток к замораживанию, высушиванию и аэрозолированию. Преимуществом предлагаемого способа является также отсутствие пенообразования при культивировании микроорганизмов. Применение способа позволяет удешевить процесс культивирования в целом, так как до 50% объема дорогостоящей питательной среды может быть заменено на неполярный растворитель (например, жидкий парафин), обладающий более низкой стоимостью.

Количество масляной фазы, добавляемой к стандартной среде для увеличения урожая и качества получаемой биомассы, составляет 12,5-50% от всего объема питательной среды. Оптимальное количество этерифицированного полиглицерина, добавляемого в масляную фазу, составляет 0,1-5% (объем/объем). Концентрации ЭПГ в масляной фазе и количество масляной фазы в питательной среде выше и ниже указанных значений приводят к худшим результатам.

Способ прост по технике выполнения и может быть использован в любой лаборатории и в любом производстве без переоборудования.

Использование: микробиология, для получения биомассы микроорганизмов. Сущность изобретения: микроорганизмы культивируют в жидкой питательной среде с добавлением 0,1 - 5%-ного раствора этерифицированного полиглицерина в жидком углеводороде в качестве поверхностно-активного вещества. Поверхностно - активное вещество добавляют в питательную среду в количестве 12,5 - 50 об.%. 2 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ путем культивирования их в жидкой питательной среде с добавлением поверхностно-активного вещества, отличающийся тем, что, с целью повышения устойчивости к стрессовым факторам и увеличения скорости роста, в качестве поверхностно-активного вещества используют 0,1 - 5%-ный раствор этерифицированного полиглицерина в жидком углеводороде. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор этерифицированного полиглицерина добавляют в питательную среду в количестве 12,5 - 50 об.%.