Способ определения размера клеток Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

10

113373Д9

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для определения размера животных и микробных клеток, морфологического показателя физиологического состояния клеток.

Целью изобретения является повышение точности определения размеров разлилных видов микробных и животных Клеток.

Указанная цель достигается тем, что клетки помещают в инкубационную среду, вводят стабилизирующую добав- ,ку с последующим фотометрированием, в качестве добавки используют поли- этиленгликоль и дополнительно опре- деляют показатель преломления клеток.

Способ осуществляется следующим образом.

Приготавливают инкубационную среду растворением необходимых минеральных солей для поддержания рН и изото- ничности среды, В зависимости от ви. ления среды fj., экстраполяцией прямой до пересечения с осью абсцисс получают значение показателя преломления клетки lu. Найденные параметры о и j.( подставляют в формулу и вычисляют размер клетки:

p p-i

47/-М„(т-1)

(1)

где г - радиус клетки

15

/1 - длина волны света га - относительный показатель преломления,

га },

Пример 1. Определение размеров дрожжевых клеток Scizosachara- myces c-pecies.

Клетки выращивают на агаризован- ном сусле 48 ч, дважды отмывают физиологическим раствором. Готовят инкубационную среду,растворением.поли- этиленгликоля (молекулярная масса

20 тыс,) в 0,15 М NaCl забуференном да клеток и условии эксперимента кон- 25 н А Я

тгл-шпптч гзтттлА о/-чттл-гт т,т тлН ncs rrt,l кт ПЛГ Р тэо-пс,- :J tr(trI

20

центрацию солей и рН среды могут варь ировать. В инкубационную среду вносят навеску полиэтиленгликоля и переме- шившот до полного растворения полимера , Концентрацию полиэтнленгликоля увеличивают до тех пор, пока пока- затель преломления среды не достиг- нет значения 1,38-1,4. Из исходного концентрированного раствора приготавливают разведением серию растворов с показателем преломления 1 ,,33-1,4 с градиентом показателя преломления примерно 0,01, Таким образом получают, ряд из 5-6 значений показателя - преломления jU , р , ., ., р., где 1 д - показатель преломления инкуба-,., ционной среды добавок полиэтилен- гликоля. Показатели преломления сред измеряют на рефлектометре. В пробирку дозируют постоянный объем среды с определенным значением показателя преломления, В каждую пробирку вносят одинаковые концентрации клеток и тщательно перемешивают до полного диспергирования клеток в среду. Суспензию переносят в кювету спектрофотометра и измеряют спектральную зависимость оптической плотности Из спектральной зависимости оптической плотности определяют волновой экспонент п для каждого |U.j.p. По определенному п для |ирИЗ графика или таблицы п n(t) находят параметр р. Далее из

п,- зависимости ув от показателя прелом30

мальное значение рН жизнедеятельности клеток данного штампа). Показатель преломления данной среды составлял 1,384. Из исходного концентрированного раствора готовят разведением в забуференном 0,15 М NaCl растворы .с показателями преломления 1,353; 1,,357 1,363; 1,373. Показатель пра- л омления инкубационной среды -без по35 лиэтиленгликоля jUj, 1,334. Измерения показателей преломления сред проводят на рефлектометре ИРФ-23. В пробир- ,ки дозируют по 2 мл среды с определенным значением показателя прелом-

40 ления. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл концентрированной суспензии и тщательно перемешивают. Полученные суспензии переносят в оптическую кювету длиной 1 см и измеряют на спек45 трофотометре СФ-28 зависимость оптической плотности от длины волны в ди1апазоне длин волн 400-600 нм. По измеренным данным строят графики IgD- IgAj из наклона полученных прямых определяют волновой экспонент п для каждого значения jU . Для jU волновой экспонент составлял О, 98. Далее

п.- из построения YD - fx экстраполяцией

55 прямой до пересечения с осью абсцисс получают значен:ие-показателя преломления клетки |Uj., 1,404. Определив (Li, вычисляют относительный показатель преломления клетки ,404/1,334

ления среды fj., экстраполяцией прямой до пересечения с осью абсцисс получают значение показателя преломления клетки lu. Найденные параметры о и j.( подставляют в формулу и вычисляют размер клетки:

p p-i

47/-М„(т-1)

(1)

где г - радиус клетки

0

мальное значение рН жизнедеятельности клеток данного штампа). Показатель преломления данной среды составлял 1,384. Из исходного концентрированного раствора готовят разведением в забуференном 0,15 М NaCl растворы .с показателями преломления 1,353; 1,,357 1,363; 1,373. Показатель пра- л омления инкубационной среды -без по5 лиэтиленгликоля jUj, 1,334. Измерения показателей преломления сред проводят на рефлектометре ИРФ-23. В пробир- ,ки дозируют по 2 мл среды с определенным значением показателя прелом-

0 ления. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл концентрированной суспензии и тщательно перемешивают. Полученные суспензии переносят в оптическую кювету длиной 1 см и измеряют на спек5 трофотометре СФ-28 зависимость оптической плотности от длины волны в ди1апазоне длин волн 400-600 нм. По измеренным данным строят графики IgD- IgAj из наклона полученных прямых определяют волновой экспонент п для каждого значения jU . Для jU волновой экспонент составлял О, 98. Далее

п.- из построения YD - fx экстраполяцией

5 прямой до пересечения с осью абсцисс получают значен:ие-показателя преломления клетки |Uj., 1,404. Определив (Li, вычисляют относительный показатель преломления клетки ,404/1,334

1,05. Из графика ()з) для ,05 находим параметр р. При ,98 искомая величина ,95. Подставив найденные параметры р и m в формулу (1) получаем радиус клетки ,7 мкм.

Пример 2. Определение размеров микробных клеток.

В эксперименте использовали 24-часовую культуру, вы ращенную на жидкой минеральной среде. Клетки дважды отмывали физиологическим раствором. Готовили инкубационную ср.еду растворением полиэтиленгликоля в трис-буфере рН 7,4, Дальнейшие действия по при- готовлению ряда инкубационных сред с различным значением показателей преломления,- приготовлению суспензии клеток, фотометрированию и т.д. аналогичны примеру 1.

В среде с (0.1,334 волновой экспонент был равен 2. Показатель преломления клеток .coli ,38, относительный показатель преломления ,03, параметр ,7. Отсюда размер клеток 0,68 мкм.

П р и м е р 3. Определение размеров эритроцитов человека.

Эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором от белков плаз-

ор М.Циткина 5275

Составитель Е.Колмакова Техред И,Верес

Корр Под

Тираж 775 ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4

мы. Готовили инкубационную среду растворением полиэтиленгликоля в фосфатном буфере с рН 7,2. Дальнейшие действия аналогичны примерам 1 и 2 за исключением выбора спектрального диапазона. В связи с наличием полос поглощения при 600 нм гемоглоби- ном эритроцитов, измерения оптической плотности проводились в диапазоне 600-900 нм.

В среде с jU(,1,334 ,3. Показатель прелоьшения эритроцитов 1,42, относительный показатель преломления 1,07, параметр f 3,7. Отсюда размеры эритроцитов 2,3 мкм.

Формула изобретения

Способ определения размера клеток путем помещения клеток в инкубационную среду, введения стабилизирующей добавки с последующим фотометрирова- нием, отличающийся, тем, что, с целью повьш1ения точности оп- .ределения, в качестве добавки исполь зуют полиэтиленгликоль и дополни- -тельно определяют показатель прелом- :ления клеток.

Корректор И.Муска Подписное

Для повышения точности определения клетки помещают в инкубационную среду, добавляют полиэтилен- гликоль. Определяют показат.ель пре- ;1омления клеток и фотометрируют. 00 оо 00 4 СО