Способ определения адгезии лейкоцитов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике специфической сенсибилизации лейкоцитов у обследуемых лиц.

Целью изобретения является повышение точности определения адгезии лейкоцитов крови.

Способ осуществляют следующим образом.

Лейкоцитарную взвесь из цельной гепа- ринизированной крови получают путем осаждения эритроцитов 0,9-1,1 %-ной желатиной на среде 199 Выдерживают смесь 10-15 мин при 37°С Отбирают надосадок. Суспензию, находящуюся в надосадочной жидкости, отмывают в режиме 200 g в течение 10 мин и 0 05-0 15 мл клеточной взвеси

на среде 199 в концентрации 1-1,5 млн/мл помещают в лунки плоскодонных пластин для иммунологических реакций. Пластины предварительно обрабатывают средой 199 в течение 30 мин

Планшеты инкубируют в течение 1,5-2 ч при 37°С в присутствии 5% С02, или буферного раствора (ХЕПЕС) для создания рН 7,0- 7,2. По окончании инкубации содержимое лунок трижды промывают средой 199 и последний раз бесцветным физиологическим раствором (рН 7-7,2) для удаления остатков красителя.

Количество прилипших клеток определяют путем тестирования активности фермента МП, содержащегося в азурофильных гранулах этих клеток. С этой целью в лунки

О

ю VJ о о

00

добавляют 0,1-0,15 мл Н20, выдерживают в течение 15-20 мин. Фермент высвобождается в жидкую среду, вследствие осмотического лизиса клеток. Добавляют субстратную смесь, состоящую из 0,04%-го раствора ортофенилендиаммна и 0,02%-го раствора Н202, при их соотношении (102:1)-(98:1) (ОРД на фосфат-цитратном буфере рН 5,0). По истечении 5-10 мин реакция останавливается добавлением 1 N bteSCM, оптическую плотность реакционной смеси снимают в многоканальном спектрофотометре Multiskan Plus. Результаты оптической плотности, соответствующие активности исследуемой МП в прилипших клетках, переводят в ус.ед. активности фермента перок- сидазы хрена (удельная активность 350-500 ед/мг).

Для построения стандартной калибровочной кривой используется приготовленный раствор перексидазы хрена с известной концентрацией этого фермента и активность этого фермента тестируется в той же реакционной системе. Стандартную кривую строят, откладывая по оси абсцисс весовые количества пероксидэзы хрена, а по оси ординат соответствующую им оптическую плотность.

Объектом исследования служит гепари- низированная кровь, полученная из вены в количестве 10 мл. Далее полученную кровь делят на 10 порций по 1 мл и проводят 10 параллельных исследований. С целью разделения клеток белой крови от эритроцитов кровь смешивают с 0,9%-ным раствором желатина на питательной среде 199 в соотношении 1:2. Инкубируют в течение 10 мин при 37°С. По истечении инкубации образовавшийся верхний слой, состоящий преимущественно из лейкоцитов, отсасывают и отмывают от желатина при 1000 об/мин в течение 10 мин.

После отмывания к клеткам добавляют 1 мл среды 199 или сбалансированного солевого раствора. Проводят счет клеток в краске следующего состава, %: тритон-Х- 1000,2; эозин 0,1; азур 11 водорастворимый 0,015; НаО до 100 (разведение клеточной суспензии 1:10).

Дифференцированный счет проводят в камере Горяева с учетом формы ядра, что позволяет вывести процент полинуклеар- ных и мононуклеарных клеток, наряду с абсолютным количеством лейкоцитов и нейтрофилов.

В лунки плоскодонных планшет для иммунологических реакций вносят 0,1 мл исследуемой клеточной взвеси с концентрацией 1-106 нейтрофилов/мл. Далее планшеты инкубируют в течение 1,5 ч при 37иС в присутствии 5% СОа. По окончании инкубации содержимое лунок трижды промывают средой 199 и последний раз бесцветным

физиологическим раствором рН 7,0 для уда- ления остатков красителя. Затем в лунки добавляют 0,f мл Н20, выдерживают в течение 20 мин и далее вносят в лунки 0,1 мл смеси , 0,04% ортофенилендиамина на фосфат-цитратном буфере рН 5,0 и 0,02% раствора Н202 при их соотношении соответственно равном (в 10,2 мл ОРД вносят 0,1 мл 0,02% На02). Через 5 мин реакция останавливается добавлением 0,1 мл 1 N H2S04. Оптическую плотность реакционной смеси снимают в спектрофотометре Multlshan Plus.

Сравнительный анализ предлагаемого и известного способов приведен в таблице.

Формула изобретения Способ определения адгезии лейкоцитов, включающий их выделение и последующее определение количества прилипших к

поверхности пластика клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, суспензию лейкоцитов вносят в лунки планшета в концентрации 1-1,5 млн/мл лейкоцитов, инкубируют 1,5-2

ч при рН 7.0-7,2 с последующей промывкой и лизированием, а адгезию определяют по активности миелопероксидазы в прилипших клетках, при этом в лунки дополнительно вносят смесь 0,04% раствора

ортофенилендиамина и 0,02% раствора перекиси водорода в соотношении соответственно равном (98:102): 1, после чего снимают показатель оптической плотности, пропорционально соответствующий количеству

прилипших клеток.

Изобретение относится к клинической иммунологии, а также для диагностики специфической сенсибилизации лейкоцитов у обследуемых лиц. Целью изобретения является повышение точности способа. Способ осуществляют путем инкубирования цельной крови с 0,9-1,1%-ным раствором желатины на среде 199 в течение 10-15 мин с последующим выделением лейкоцитов Полученную суспензию лейкоцитов из над- осадка осаждают и вносят в лунки планшета в концентрации 1-1,5 млн/мл ядросодержа- щих клеток в среде 199, затем клетки инкубируют 1,5-2 ч при рН 7,0-7,2 с после,- ющей промывкой и дозированием. Определение адгезии проводят по активности миелопероксидазы в прилипших клетках. Для этого в лунки планшета дополнительно вносят смесь ортофенилендиамина и перекиси водорода в соотношении (98-102) 1, после чего снимают показатель оптической плотности, пропорционально соответствующий количеству прилипших клеток. Способ является значительно более точным. Положительный эффект способа дает возможность значительно повысить точность метода и сократить время его выполнения.