СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ В ПРОЦЕССЕ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/06 C12M1/00 G01N15/14 

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к оптическим способам определения количества таких микробиологических объектов, как бактерийные клетки, грибы, дрожжи в процессе их культивирования, и может быть использовано для диагностических целей в медицине, а также контроле биотехнологических процессов.

Известно, что оценка количества микробиологических объектов в процессе их культивирования основана на так называемых кривых роста, функциональной временной зависимости количества клеток в процессе их развития. Для бактерийных клеток на кривой роста выделяют четыре участка, соответствующие фазам развития бактериальной популяции, называемые соответственно лаг-фаза роста, логарифмическая или экспотенциальная фаза роста, стационарная фаза роста и фаза отмирания [Albert G.Moat, John W.Foster, Michael P.Spector. Microbial Physiology. 4th ed. - New York.- Copyright by Wiley-Liss, Inc. - 2002 - 714 рр]. При этом количественная оценка развития клеток бактерий в процессе их культивирования осуществляется, как правило, в логарифмической фазе [Baranyi J., Pin С.Estimating bacterial growth parameters by means of detection times./Apl. Environmen. Microbiol. - 1999. - Vol.65. - №2. P.732-336]. Известен способ определения количества микробиологических объектов по изменению мутности жидкой питательной среды в процессе их культивирования [Microbiology Reader Bioscreen С and Software Research Express - Microbiological Growth Curves - http://www.bionewsonline. com/b/5/growth_curves.htm]. Изменение мутности питательной среды измеряют оптическим спектрофотометром. Кривая мутности представляет собой графическую зависимость параметра оптическая плотность раствора от времени. При этом оптическая плотность состоит из двух составляющих: мутность раствора, обусловленная изменением количества микробиологических клеток в процессе их культивирования, и мутность раствора, обусловленная изменением физико-химических параметров питательной среды. Путем математической экстраполяции кривой измерения мутности можно определить общую концентрацию клеток, время удваивания клеток вследствие их размножения, а также изменения данных параметров микробиологических клеток в процессе их культивирования.

К недостаткам данного способа определения количества микробиологических объектов следует отнести то, что способ не позволяет измерять значения оптической плотности раствора, обусловленные только изменениями количества микробиологических клеток в процессе их культивирования. Точность данного способа определяется необходимостью надежной регистрации оптической плотности раствора в интервале 0.3-1.0, что соответствует концентрации бактерийных клеток 10¹²-10¹⁴ клеток/м³ в исследуемом растворе. Поэтому способ приводит к значительным погрешностям измерений в случае измерения растворов с концентрацией клеток меньше 10¹² клеток/м³.

Известен способ определения количества микробиологических объектов, который основан на расчетах диэлектрической проницаемости с измерений спектров импеданса жидкой питательной среды в процессе их культивирования [Патент США №20040009572 от 15.01.2004, МПК С12М1/00. Apparatus for the analysis of microorganisms growth and procedure for the quantification of microorganisms concentration; K.G. Ong, J. Wang, R.S. Singh, L.G. Bachas, C.A. Grimes / Monitoring of bacteria growth using a wireless, remote query resonant-circuit sensor: application to environmental sensing. // Biosensors & Bioelectronics 2001 - Vol.16 - P.305-312]. Диэлектрическая проницаемость среды -комплексная величина, действительную и мнимую часть которой рассчитывают по частотным зависимостям активного и реактивного сопротивлений в спектрах импеданса. Действительную часть рассчитывают по значениям частоты резонанса, на которой наблюдается максимум частотной зависимости сопротивления в спектрах импеданса, а мнимую часть - по значениям частоты, на которой реактивное сопротивление в спектрах импеданса имеет нулевое значение. Процесс измерения спектров импеданса заключается в следующем. Погружая два или три электрода в жидкую питательную среду с культивированными микробиологическими клетками, измеряют напряжение при постоянном токе. С ростом концентрации клеток комплексная диэлектрическая проницаемость среды возрастает, что приводит к изменению емкости конденсатора между погруженными электродами, и сопровождается смещением частоты резонанса и частоты нулевого значения реактивного сопротивления. Измеряя новые значения указанных частот, можно определить величину изменения концентрации клеточных культур в процессе их культивирования.

К недостаткам данного способа определения количества микробиологических объектов следует отнести его ограниченность вследствие возможности регистрации клеток в растворах с концентрацией больше 10¹³ клеток/м³. Кроме того, на точность измерений оказывают влияние внешние факторы: поляризация электродов в процессе измерений, образование пузырьков газа на поверхности электрода. Последние приводят к изменению потенциала электрода и емкости междуэлектродного конденсатора.

Известен способ определения количества микробиологических объектов, который основан на анализе изменения интенсивности свечения флуоресцентных молекул-маркеров, которые объединены с фрагментами молекулярного строения клетки. На внешней мембране клетки имеется порядка 10⁵ различных биологических рецепторов, взаимодействие с которыми флуоресцентных молекул-маркеров позволяет регистрировать микробиологические клетки. Такими молекулами-маркерами являются, например, молекулы флуоресцеин диацетата, торговая марка OREGON GREEN [Патент WO №02/057482 от 17.01.2002. Method for differential analysis of bacteria in sample], метиламбелиферон [Патент США №2003/0138906 от 24.07.2003. Fluorescence test for measuring heterotrophic bacteria in water] и ряд других соединений [Патент США №6632632 от 14.10.2003. Rapid method of detection and enumeration of sulfide-producing bacteria in food products; Патент WO №99/10533 от 17.04.1999. Rapid detection and identification of microorganisms]. Оценка изменения количества клеток микроорганизмов в процессе их культивирования возможна путем измерения интенсивности свечения молекул-маркеров и заключается в следующем [Brian J. Mailloux, Mark E. Fuller. Determination of in situ bacterial growth rates in aquifers and aquifer sediments. // Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - Vol.69, No.7. - P.3798-3808]. В процессе культивирования клеток с возрастанием их концентрации средняя интенсивность свечения молекул-маркеров падает. Причем каждый раз, когда концентрация клеток удваивается, интенсивность их свечения, с учетом фонового излучения, уменьшается вдвое. Поэтому считают, если в процессе флуоресцентного анализа интенсивность свечения молекул-маркеров с клетками падает на половину, то число клеток в процессе культивирования удвоилось. Определив в начале проведения анализа среднюю интенсивность свечения исходных клеток I_p и среднюю интенсивность фонового свечения клеток, не содержащих молекул-маркеров I_b, и учитывая, что в момент времени t средняя интенсивность свечения молекул-маркеров I_t в процессе культивирования клеток концентрации С, при исходный концентрации С₀ меняется по закону:

По измерениям изменения интенсивности свечения можно рассчитать численные значения концентрации клеток микроорганизмов в процессе их культивирования, и время, за которое наблюдается удвоение популяции клеток.

К недостатку данного способа определения количества микробиологических объектов следует отнести его сложность и высокую себестоимость, вызванную необходимостью использования дорогих химических реактивов и оборудования для проведения измерений. Кроме того, ассортимент флуоресцирующих молекул-маркеров ограничен, стоимость их высокая, и в большинстве случаев являются вредными для человеческого организма.

Наиболее близким к предлагаемому способу известен способ определения распределения размеров взвешенных частиц в потоке жидкости [Патент Украины №42971 от 22.09.2000 г. «Способ и устройство для определения распределения размеров взвешенных частиц в потоке жидкости»]. Способ базируется на регистрации флуктуации интенсивности рассеянного частицами света путем статистического набора изменений амплитуды и длительности импульсов для частиц заданного размера, построения на основе данных измерений корреляционной функции вида F(U,t), которая выражает статистические характеристики интенсивности рассеяния света исследуемыми частицами, и получение распределения частиц по размерам путем решения интегрального уравнения Фредгольма первого рода:

где r_min и r_мах - нижняя и верхняя граница диапазона размеров частиц, которые регистрируются;

n(r) - функция распределения частиц по размерам;

K(U,t,r) - функция распределения нормированных значений амплитуд и длительностей регистрированных импульсов рассеянного света от калибровочных частиц, которая является результатом предыдущего зондирования потока жидкости монохроматическим когерентным светом полимерных латексов заданного размера и известным показателем преломления.

Недостатком данного способа являются значительные погрешности при определении количества микробиологических объектов, обусловленные появлением посторонних частиц - продуктов распада питательной среды в процессе культивирования исследуемых микробиологических объектов. Задачей изобретения является усовершенствование способа определения распределения размеров взвешенных частиц в потоке жидкости путем независимой регистрации частиц в процессе культивирования микробиологических объектов в питательной среде, содержащей исследуемые клетки, и в которой исследуемые клетки отсутствуют, что позволит обеспечить количественную оценку изменений микробиологических объектов в отдельно выбранном интервале размеров в процессе их культивирования. Это также позволит исключить погрешности, обусловленные появлением посторонних частиц - продуктов распада питательной среды в процессе культивирования исследуемых микробиологических объектов.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения количества микробиологических объектов в процессе их культивирования, включающем подачу потока жидкости, содержащей исследуемые объекты с постоянной скоростью, зондирование потока жидкости с помощью когерентного монохроматического оптического излучения, калибровка, путем построения двухмерного распределения регистрированных импульсов в заданном объеме от сферических частиц с известным показателем преломления радиуса r в виде функции K(U,t,r) по значениям нормированных амплитуд U, и длительности t импульсов рассеянного излучения, зондирование потока жидкости с исследуемыми объектами тем же монохроматическим когерентным светом и в том же объеме, в котором проводится калибровка, регистрацию импульсов рассеянного света от зондирующих частиц под заданным углом в интервале от 1 до 360 градусов, определение функции n(r) размерного распределения исследуемых частиц путем регистрации импульсов от зондирующих частиц, сортировки регистрированных импульсов для построения двухмерного распределения их амплитуд и длительности в поддиапазонах с границами, в случае зондирования частиц, выбранных для калибровки, нормировки численных значений величин амплитуды и длительности импульсов в каждом поддиапазоне, построения по нормированным значениям функции вида F(U,t), определяющей размерное распределение исследуемых объектов в интервале размеров от r_min до r_max как

согласно изобретению, отобранные для исследований микробиологические объекты культивируют в жидкой питательной среде, определяют временные зависимости изменения численности микробиологических объектов и фоновых частиц в той же среде, для этого исследуемую жидкую питательную среду с микробиологическими объектами и без них разводят в равных пропорциях в физиологическом растворе хлорида натрия, 5% растворе глюкозы или деионизированной воде, отдельно определяют общее размерное распределение микробиологических объектов и фоновых частиц в высокочистой жидкости, которая содержит микробиологические объекты, и общее размерное распределение фоновых частиц в высокочистой жидкости, в которой микробиологические объекты отсутствуют, определяют численное значение микробиологических объектов в заданном интервале размеров путем расчета количества частиц в питательной среде с клетками и без них, определяют относительное содержание микробиологических объектов в заданном интервале размеров путем расчета отношения доли микробиологических объектов в заданном интервале размеров к общему количеству микробиологических объектов, строят временные зависимости изменений количества микробиологических объектов и их относительного содержания в заданном интервале размеров в процессе культивирования.

Из литературных источников известно, что количественные изменения микробиологических объектов в процессе их культивирования наиболее активно проявляются в логарифмической фазе роста, при которой все клетки делятся постоянно путем двоичного расщепления, а размножение клеток происходит по геометрической прогрессии. На данной фазе роста скорость прироста клеток постоянна, и определяется временем появления нового поколения клеток. В зависимости от типа клеток, время генерации появления нового поколения клеток бактерий есть в пределах от 12 минут до 24 часов или больше. Частота смены генераций зависит от многих факторов: концентрации питательных веществ, условий инкубации - температура, рН, скорость перемешивания. Надежность регистрации клеток микроорганизмов инструментальным устройством включает в себя эту нижнюю концентрацию клеток в растворе, которую может зафиксировать прибор. Для способа, основанного на изменениях мутности жидкой питательной среды, нижний предел регистрации клеток - 10¹² клеток/м³. Способ, основанный на расчетах диэлектрической проницаемости по измерениям спектров импеданса жидкой питательной среды, имеет нижний предел регистрации 10¹³ клеток/м³. Если считать, что время появления нового поколения клеток 24 минуты, а начальная концентрация клеток в растворе 10⁸ клеток/м³, надежно регистрировать данный вид клеток микроорганизмов указанными методами можно, по крайней мере, спустя 5,5 часов от начала их роста. Наиболее чувствительные на данное время флуоресцентные методы анализа базируются на анализе изменения интенсивности свечения молекул-маркеров при их взаимодействии с клетками микроорганизмов. Известно, что для измерения флюоресценции, оптимальное число молекул-маркеров на одну клетку есть в пределах от 1000 до 100000 единиц. Поэтому флуоресцентные методы анализа при определенном выборе молекул-маркеров позволяют регистрировать клетки микроорганизмов на уровне 10⁷ клеток/м³. Недостатком указанных выше методов является возможность регистрации лишь общего количества клеток микроорганизмов в растворе, разделяя их по морфологическим признакам. Авторами впервые предложено для определения изменения количества клеток микроорганизмов в процессе их культивирования использовать измерения морфологического состава клеток путем определения размерного распределения клеток микроорганизмов в жидкой питательной среде по изменениям интенсивности рассеянного ими света. В известном способе определения распределения размеров взвешенных частиц в потоке жидкости о размерах частиц судят по интенсивности рассеянного ими света путем измерения двух параметров: амплитуды и длительности импульса рассеянного частицами света, дальнейшего статистического набора указанных параметров и нахождения размерного распределения частиц по данным статистического набора путем решения интегрального уравнения Фредгольма первого рода. Процессу культивирования клеток микроорганизмов в жидком питательном растворе сопутствуют изменения размерного состава частиц вследствие как появления в растворе новой популяции клеток по результатам их размножения, так и продуктов деструкции питательной среды. Для разделения содержимого клеток микроорганизмов от общего количества частиц, авторы предлагают раздельное нахождение размерных распределений отдельно фоновых частиц, совместно фоновых частиц и клеток микроорганизмов в жидкой питательной среде по измерениям рассеянного ими света по двух параметрам: амплитуде и длительности импульса рассеянного частицами света. При этом питательные среды, с клетками микроорганизмов и без них, культивируются одновременно при одинаковых условиях. По статистическим данным измерений амплитуды и длительности импульсов путем решения двух интегральных уравнений Фредгольма первого рода можно рассчитать действительное количество клеток микроорганизмов заданного морфологического состава, определить их относительное содержимое к общему количеству клеток и получить временные зависимости данных параметров.

На фиг.1 изображена временная зависимость измерения концентрации частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №1 (кривая (+)) в физиологическом растворе. Верхняя (□) и нижняя (о) кривые задают границы доверительного интервала.

На фиг.2 изображена временная зависимость измерения концентрации частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 (кривая (+)) в физиологическом растворе. Верхняя (□) и нижняя (о) кривые задают границы доверительного интервала.

На фиг.3 изображено распределение по размерам частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе в интервале размеров 0,2-2,0 мкм. Кривая (о) -суспензия частиц, содержащая бактерийные клетки Е. coli из нестерилизированного сосуда; кривая (+) - суспензия частиц, содержащая бактерийные клетки Е. coli из стерилизированного сосуда.

На фиг.4 изображено распределение по размерам частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе в интервале размеров 0,2-2,0 мкм. Кривая (о) - суспензия частиц, содержащая бактерийные клетки Е. coli из нестерилизированного сосуда; кривая (□) - суспензия частиц, содержащая бактерийные клетки Е. coli из нестерилизированного сосуда после 24 часов.

На фиг.5 изображено распределение по размерам частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе в интервале размеров 0,2-2,0 мкм. Кривая (_*) - суспензия частиц, содержащая бактерийные клетки E.coli из стерилизированного сосуда; кривая (+) - суспензия частиц, содержащая бактерийные клетки Е. coli из стерилизированного сосуда после 24 часов.

На фиг.6 изображено относительное содержание частиц - продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе в интервале размеров 0,2-2,0 мкм. Кривая 1 - суспензия частиц на начало процесса культивирования, кривая 2 - суспензия частиц после инкубации в течение 4 часов, 3 - суспензия частиц после инкубации в течение 5 часов, кривая 4 - суспензия частиц после инкубации в течение 6 часов.

На фиг.7 изображено относительное содержание частиц - бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе в интервале размеров 0,2-2,0 мкм. Кривая 1 - суспензия частиц на начало процесса культивирования, кривая 2 - суспензия частиц после инкубации в течение 4 часов, 3 - суспензия частиц после инкубации в течение 5 часов, кривая 4 - суспензия частиц после инкубации в течение 6 часов.

На фиг.8 изображено нормированное распределение относительных изменений частиц - бактерийных клеток Е. coli по отношению к данным на начало процесса культивирования в жидкой питательной среде №3 в интервале размеров 0,2-2,0 мкм. Кривая 1 - нормированное распределение бактерийных клеток Е. coli на начало процесса их культивирования; кривая 2 - нормированное распределение бактерийных клеток Е. coli по отношению к нормированному исходному распределению данных клеток в процессе их культивирования в течение 4 часов; кривая 3 - нормированное распределение бактерийных клеток Е. coli по отношению к нормированному исходному распределению данных клеток в процессе их культивирования в течение 5 часов, кривая 4 - нормированное распределение бактерийных клеток Е. coli по отношению к нормированному исходному распределению данных клеток в процессе их культивирования в течение 6 часов.

На фиг.9 изображено относительное содержание частиц - гриба Mucor racemosus и продуктов распада питательной среды Сабуро в 5% растворе глюкозы на 2 сутки культивирования в интервале размеров 0,2-2,0 мкм.

Способ определения количества микробиологических объектов в процессе их культивирования предусматривает: обеспечение подачи исследуемых микробиологических объектов в потоке жидкости с постоянной скоростью; прохождение луча лазера через поток жидкости с исследуемыми клетками микроорганизмов таким образом, чтобы поперечное сечение луча в месте пересечения его клетками было больше, чем поперечное сечение исследуемых клеток, и при этом, во времени, луч лазера могла пересекать лишь одна клетка; дальнейшее определение распределения по размерам клеток в процессе их культивирования. Для этого предварительно осуществляется процедура калибровки устройства. Она состоит в построении функции, определяющей двухмерное распределение регистрированных импульсов в заданном объеме от сферических частиц с известным показателем преломления. Для этого с потоком жидкости в течение выбранного промежутка времени все частицы в потоке жидкости пересекают зондированный лазерный луч, рассеивают при этом излучение, импульсы которого регистрируют по амплитуде и длительности. Регистрированные импульсы сортируют по амплитуде и длительности, для чего диапазон амплитуд импульсов разделяют на m поддиапазонов и ограничивают снизу напряжением уровня шумов фотоэлектрической системы регистрации, а сверху напряжением насыщения входного усилителя, а диапазон длительностей разделяют на n поддиапазонов и ограничивают его верхним и нижним значениями, соответствующие времени прохождения клетками максимального и минимального сечений лазерного луча. Значения амплитуд и длительностей импульсов в указанных поддиапазонах нормируют в соответствии с определенным алгоритмом. Характеристики двухмерного распределения размеров частиц строят для каждого из упомянутых поддиапазонов. Процедура определения распределения по размерам клеток в потоке жидкости состоит: в зондировании потока жидкости с исследуемыми объектами тем же монохроматическим когерентным светом в том же объеме, в котором проводилась калибровка; построении по результатам измерений функции, определяющей статистические характеристики рассеянного клетками света; математическим разложением данной функции на составляющие по амплитуде и длительностям регистрированных импульсов для каждого из поддиапазонов по данным, полученным в результате процедуры калибрования. Для выключения зависимости полученных результатов от времени измерения, проводится операция нормирования. В случае, когда процедура измерения предусматривает для получения результата измерения проведение лишь одной операции замера, процедура нормирования состоит в проведении операции деления численного значения величины в каждом поддиапазоне на сумму численных значений величин во всех поддиапазонах, на которые разбиты интервалы амплитуд и длительностей регистрированных импульсов. В случае, когда процедура измерения предусматривает для получения результата измерения проведение по крайней мере двух операций замера: основной и поверочной, процедура нормирования состоит в операции деления числовых значений величин в каждом поддиапазоне для основной и поверочной операций замера на время проведения замера, и дальнейшим вычитанием в каждом поддиапазоне числовых значений величин, полученных для поверочной операции замера, от числовых значений величин, полученных для основной операции замера, и делением полученных таким образом числовых значений величин в каждом поддиапазоне на сумму числовых значений числовых величин амплитуд и длительностей регистрированных импульсов, полученных при проведении процедуры калибровки, строится матрица вида A(m,n), элемент которой а_ij(m, n,) равен нормированному значению амплитуд и длительностей регистрированных импульсов рассеянного света для отдельно выбранной сферической частицы заданного размера и показателя преломления. По нормированным значениям числовых величин амплитуд и длительностей регистрированных импульсов, полученных при проведении процедуры измерения, строится матрица вида В(m,n,), элемент которой b_ij(m,n) равен нормированному значению амплитуд и длительностей регистрированных импульсов. Определение распределения по размерам частиц в потоке жидкости осуществляется путем решения уравнения

где i - число выбранных для калибровки сферических частиц заданного размера

и показателя преломления,

j - порядковый номер элемента и j≤i,

φ_i - постоянная величина в пределах от 0 до 1.

Определение численности микробиологических объектов в процессе их культивирования достигается проведением поочередных измерений временных зависимостей светорассеивающих параметров жидкой питательной среды, в которой культивируют исследуемые клетки микроорганизмов, с клеточными объектами, и без них. Повышение точности измерений достигается путем кратного разведения в одинаковых пропорциях жидкой питательной среды с клетками и без них в одной из высокочистых жидкостей: физиологический раствор хлорида натрия, 5% раствор глюкозы или деионизированная вода. Процедура измерения состоит в следующем. Поочередно определяют общее размерное распределение частиц в высокочистой жидкости, которая содержит жидкую питательную среду с клеточными объектами и без них. Численное значение микробиологических объектов в заданном интервале размеров достигается путем вычитания в данном интервале число частиц в питательной среде от числа частиц в питательной среде с клетками. Определение относительного содержания микробиологических объектов в заданном интервале размеров осуществляется путем расчета отношения доли микробиологических объектов в заданном интервале размеров к общему числу микробиологических объектов. По полученным данным строят временные зависимости изменений количества микробиологических объектов и их относительного содержания в заданном интервале размеров в процессе культивирования.

При определении распределения частиц по размерам результаты измерений носят статистический характер, и для оценки их достоверности выполняется их статистический анализ. Для этого замер каждой пробы жидкой питательной среды проводят не меньше 5 раз с дальнейшей статистической обработкой полученных результатов путем определения величин среднего значения и стандартного отклонения результатов измерений. При оценке достоверности результатов измерения выходят из границ доверительного интервала относительно среднего значения, которые рассчитывают по формуле

где t - коэффициент Стьюдента для числа измерений s и доверительной вероятности Р. В дальнейшем, при расчетах, принимается Р=0,95. Это означает, что в интервал попадает не меньше 95% результатов измерений.

Возможность реализации способа покажем на следующих примерах.

Пример 1

Проведение исследований бактерийных клеток Escherichia coli в жидкой питательной среде №1 (мясопептонный бульон) согласно требованиям. Для этого навески сухого ферментативного пептона 10,0 г натрия хлорида 5,0 г вносят в колбу со 1 литром мясной воды, растворяют при медленном нагревании, и вносят навеску глюкозы 1,0 г, устанавливая таким образом рН, чтобы после стерилизации его значение составляло 7,3±0,2, и кипятят на медленном огне в течение 1 минуты. Среду фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,2 мкм, стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121°С в течение 15 минут. В среду вносят бактерийные клетки Escherichia coli из расчета, чтобы исходная концентрация составляла 3300 клеток/мл питательной среды. Подготовленный таким образом раствор бактерийных клеток Е. coli разливают в стерильные пробирки емкостью 5 см, закрывают их ватно-марлевыми пробками, инкубируют в термостате при 30°С. Измерения интенсивности рассеянного частицами света в питательной среде проводят с интервалом 1 час на протяжении семи часов. При этом предварительно проводят подготовку пробы, которая состоит в следующем. Раствор пробы питательной среды с бактерийными клетками после фиксированного времени инкубации в пробирке разводят в соотношении 1:100 в стерильном физиологическом растворе натрия хлорида в сосуде емкостью 200 см³, герметически закрытой резиновой пробкой с алюминиевым ободом. Полученную таким образом пробу исследуемых бактерийных клеток Е. coli набирают стерильным шприцем емкостью 20 см³, помещают в шприцевой насос, и проводят замеры изменения интенсивности рассеяния света частицами на устройстве, описанном в Патенте Украины №49164С от 10.09.2003. Способ и устройство для определения распределения размеров взвешенных частиц в потоке жидкости. Устройство предварительно калибруют по сферическим полистирольным латексам с показателем преломления n=1,56. Измерение каждой пробы проводят 5-6 раз с дальнейшим статистическим анализом результатов измерений. Между измерениями каждой пробы гидравлический тракт и оптическую кювету устройства промывают деионизированной водой. Для выбранного числа измерений s и доверительной вероятности Р=0,95 определяют коэффициент Стьюдента и границы доверительного интервала относительно среднего значения согласно формуле (5). Результаты замера временной зависимости изменения концентрации частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №1 в физиологическом растворе (кривая (+)) показаны на фиг.1. Верхняя (□) и нижняя (о) кривые задают границы доверительного интервала относительно среднего значения, определяющиеся коэффициентами Стьюдента t(5;0,95)=2,77 и t(6;0,95)=2,57. Из приведенной временной зависимости изменений концентрации частиц видно, что в пределах погрешности, рост числа частиц во время инкубации в среде не наблюдается.

Пример 2

Проведение исследований бактерийных клеток Escherichia coli в жидкой питательной среде №3 согласно требованиям. Для этого навески сухого ферментативного пептона 10,0 г, динатрия гидрофосфата 7,5 г и калия дигидрофосфата 2,5 г вносят в колбу со 1 литром мясной воды, растворяют при медленном нагревании, и вносят навеску глюкозы 10,0 г, 8 мл 1% раствора фенолового красного и 3 мл 0.5% раствора малахитового зеленого, устанавливая таким образом рН, чтобы после стерилизации его значение составляло 7,3±0,2. Среду фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,2 мкм, стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121°С в течение 15 минут. В среду вносят бактерийные клетки Escherichia coli из расчета, чтобы исходная концентрация составляла 3000 клеток/мл питательной среды. Подготовленный таким образом раствор бактерийных клеток Е. coli разливают в стерильные пробирки емкостью 5 см³, закрывают их ватно-марлевыми пробками, инкубируют в термостате при 40°С. Измерения интенсивности рассеянного частицами света в питательной среде проводят с интервалом 1 час на протяжении семи часов. При этом предварительно проводят подготовку пробы, которая состоит в следующем. Раствор пробы питательной среды с бактерийными клетками после фиксированного времени инкубации в пробирке разводят в соотношении 1:100 в стерильном физиологическом растворе натрия хлорида в сосуде емкостью 200 см³, герметически закрытой резиновой пробкой с алюминиевым ободом. Полученную таким образом пробу исследуемых бактерийных клеток Е. coli набирают стерильным шприцем емкостью 20 см³, помещают в шприцевой насос, и проводят замеры изменения интенсивности рассеяния света частицами на устройстве, описанном в Патенте на изобретение Украины №49164С от 0.09.2003. Способ и устройство для определения распределения размеров взвешенных частиц в потоке жидкости. Устройство предварительно калибруют по сферическим полистирольным латексам с показателем преломления n=1,56. Замеры каждой пробы проводят 5-6 раз с дальнейшим статистическим анализом результатов измерений. Между измерениями каждой пробы гидравлический тракт и оптическую кювету устройства промывают деионизированной водой. Для выбранного числа измерений s и доверительной вероятности Р=0,95 определяют коэффициент Стьюдента и границы доверительного интервала относительно среднего значения согласно формуле (5). Результаты замера временной зависимости изменения концентрации частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе (кривая (+)) показаны на фиг.2. Верхняя (□) и нижняя (о) кривые задают границы доверительного интервала относительно среднего значения, определяющиеся коэффициентами Стьюдента t(5;0,95)=2,77 и t(6;0,95)=2,57. Из приведенной временной зависимости измерения концентрации частиц видно, что в пределах погрешностей рост числа частиц в процессе инкубации наблюдается, начиная с 5 часов.

Пример 3

Проведение исследований бактерийных клеток Escherichia coli в жидкой питательной среде №3 согласно требованиям. Для этого навески сухого ферментативного пептона 10,0 г, динатрия гидрофосфата 7,5 г и калия дигидрофосфата 2,5 г вносят в колбу со 1 литром мясной воды, растворяют при медленном нагревании, и вносят навеску глюкозы 10,0 г, 8 мл 1% раствора фенолового красного и 3 мл 0.5% раствора малахитового зеленого, устанавливая таким образом рН, чтобы после стерилизации его значение составляло 7,3±0,2. Среду фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,2 мкм, стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121°С в течение 15 минут. Стерильную среду разливают в одинаковых частях в стерильный стеклянный сосуд емкостью 500 см³, вносят в каждый из сосудов бактерийные клетки Е. coli из расчета, чтобы исходная концентрация составляла 10000 клеток/мл питательной среды. Подготовленный таким образом раствор бактерийных клеток Е. coli с первого сосуда разливают в стерильные пробирки емкостью 5 см³, закрывают их ватно-марлевыми пробками, инкубируют в термостате при 20°С. Второй сосуд с раствором бактерийными клеток Е. coli помещают в паровой стерилизатор и стерилизуют при 121°С в течение 15 минут. По окончании стерилизации раствор бактерийных клеток Е. coli со второго сосуда разливают в стерильные пробирки емкостью 5 см³, закрывают их ватно-марлевыми пробками, инкубируют в термостате при 20°С. Измерения интенсивности рассеянного частицами света каждой пробы проводят с интервалом 24 часа инкубации. При этом предварительно проводят подготовку пробы, которая состоит в следующем. Раствор пробы питательной среды с бактерийными клетками после фиксированного времени инкубации в пробирке разводят в соотношении 1:100 в стерильном физиологическом растворе натрия хлорида в сосуде емкостью 200 см³, герметически закрытой резиновой пробкой с алюминиевым ободом. Полученную таким образом пробу исследуемых бактерийных клеток Е. coli набирают стерильным шприцем емкостью 20 см, помещают в шприцевой насос, и проводят замеры изменения интенсивности рассеяния света частицами на устройстве, описанном в Патенте на изобретение Украины №49164С от 10.09.2003. Способ и устройство для определения распределения размеров взвешенных частиц в потоке жидкости. Устройство предварительно калибруют по сферическим полистирольным латексам с показателем преломления n=1,56. Замеры каждой пробы проводят 5-6 раз с дальнейшим статистическим анализом результатов измерений. Между измерениями каждой пробы гидравлический тракт и оптическая кювета устройства промывались деионизированной водой. Для выбранного числа измерений s и доверительной вероятности Р=0,95 определяют коэффициент Стьюдента и границы доверительного интервала относительно среднего значения согласно формуле (5). Результаты измерений распределения по размерам частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе в интервале размеров 0,2-2,0 мкм показаны на фиг.3. Кривая (о) - суспензия частиц, содержащая живые бактерийные клетки Е. coli из нестерилизированного сосуда; кривая (+) - суспензия частиц, содержащая бактерийные клетки Е. coli из стерилизированного сосуда. С приведенных зависимостей видно, что на кривой, отвечающей за распределение по размерам частиц бактерийных клеток Е. coli из стерилизированного сосуда, в интервале размеров 0,25-0,65 мкм наблюдаем возрастание количества частиц, а в интервале размеров 0,65-2,0 мкм - их падение.

Результаты измерений распределения по размерам частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе в интервале размеров 0,2-2,0 мкм показаны на фиг.4. Кривая (о) - суспензия частиц, содержащая живые бактерийные клетки Е. coli из не стерилизированного сосуда; кривая (□) - суспензия частиц, содержащая живые бактерийные клетки Е. coli из не стерилизированного сосуда после 24 часов инкубации. С приведенных зависимостей видно, что на кривой, относящейся к распределению по размерам частиц бактерийных клеток Е. coli после 24 часов инкубации в интервале размеров 0,25-0,6 мкм - наблюдают возрастание количества частиц, а в интервале размеров 0,6-2,0 мкм относительное содержание частиц в обоих случаях одинаково.

Результаты измерений распределения по размерам частиц бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе в интервале размеров 0,2-2,0 мкм показаны на фиг.5. Кривая (*) - суспензия частиц, содержащая бактерийные клетки E.coli из стерилизированного сосуда; кривая (+) - суспензия частиц, содержащая бактерийные клетки Е. coli из стерилизированного сосуда после 24 часов инкубации. С приведенных зависимостей видно, что на кривой, отвечающей распределению по размерам частиц бактерийных клеток Е. coli после 24 часов их инкубации в интервале размеров 0,2-0,7 мкм, наблюдают падение количества частиц, а в интервале размеров 07-2,0 мкм - их возрастание.

Пример 4

Проведение исследований бактерийных клеток Escherichia coli в жидкой питательной среде №3 согласно требованиям. Для этого навески сухого ферментативного пептона 10,0 г, динатрия гидрофосфата 7,5 г и калия дигидрофосфата 2,5 г вносят в колбу со 1 литром мясной воды, растворяют при медленном нагревании и вносят навеску глюкозы 10,0 г, 8 мл 1% раствора фенолового красного и 3 мл 0.5% раствора малахитового зеленого, устанавливая таким образом рН, чтобы после стерилизации его значение составляло 7,3±0,2. Среду фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,2 мкм, стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121°С в течение 15 минут. Стерильную среду разливают в равных частях в стерильный стеклянный сосуд емкостью 0,5 литра, и вносят в один из сосудов бактерийные клетки E.coli из расчета, чтобы исходная концентрация составляла 10000 клеток/мл питательной среды. Подготовленные таким образом растворы жидкой питательной среды №3 и исследуемых бактерийных клеток Е. coli в питательной среде №3 разливают в стерильные пробирки емкостью 5 см³, закрывают их ватно-марлевыми пробками, и инкубируют в термостате при 37°С. Замеры интенсивности рассеянного частицами света в подготовленных образцах проводят с интервалом 1 час в течение 6 часов. При этом предварительно проводят подготовку пробы, которая состоит в следующем. Содержимое каждой пробирки, содержащей жидкую питательную среду №3 или питательную среду №3 с исследуемыми бактерийными клетками Е. coli, разводят в соотношении 1:100 в стерильном физиологическом растворе в сосуде емкостью 200 см³, герметически закрытой резиновой пробкой с алюминиевым ободом. Полученную таким образом пробу исследуемых бактерийных клеток Е. coli набирают стерильным шприцем емкостью 20 см³, помещают в шприцевой насос, и проводят замеры изменения интенсивности рассеяния света частицами на устройстве, описанном в Патенте на изобретение Украины №49164С от 10.09.2003. Способ и устройство для определения распределения размеров взвешенных частиц в потоке жидкости. Устройство предварительно калибруют по сферическим полистирольным латексам с показателем преломления n=1,56. Замеры каждой пробы проводят 5-6 раз с дальнейшим статистическим анализом результатов измерений. Между измерениями каждой пробы гидравлический тракт и оптическую кювету устройства промывают деионизированной водой. Для выбранного числа измерений s и доверительной вероятности Р=0,95 определяют коэффициент Стьюдента и границы доверительного интервала относительно среднего значения согласно формуле (5). Результаты замера относительного содержания частиц - продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе в интервале размеров 0,2-2,0 мкм показаны на фиг.6. Кривая 1 - суспензия частиц на начало процесса культивирования, кривая 2 - суспензия частиц после инкубации в течение 4 часов, 3 - суспензия частиц после инкубации в течение 5 часов, кривая 4 - суспензия частиц после инкубации в течение 6 часов. С приведенных кривых видно, что в указанном интервале размеров для относительного содержания частиц - продуктов распада жидкой питательной среды №3 наблюдаются незначительные изменения.

Результаты замера относительного содержания частиц - бактерийных клеток Е. coli и продуктов распада жидкой питательной среды №3 в физиологическом растворе показаны на фиг.7. Кривая 1 - суспензия на начало процесса культивирования, кривая 2 - суспензия частиц после инкубации в течение 4 часов, 3 - суспензия частиц после инкубации в течение 5 часов, кривая 4 - суспензия частиц после инкубации в термостате в течение времени 6 часов. С приведенных кривых видим, что в указанном интервале размеров наблюдаются существенные изменения. С увеличением времени культивации одновременно уменьшается относительное содержимое частиц в интервале размеров 0,2-0,3 мкм и возрастает относительное содержимое частиц в интервале размеров 0,3-1,3 мкм, и наблюдается максимум на кривой распределения при ≈ 0,68 мкм.

Результаты нормированного распределения относительных изменений частиц - бактерийных клеток Е. coli, по отношению к данным на начало процесса культивирования в жидкой питательной среде №3 в интервале размеров 0,2-2,0 мкм показаны на фиг.8. Кривая 1 - нормированное исходное распределение бактерийных клеток Е. coli на начало процесса их культивирования; кривая 2 - нормированное распределение бактерийных клеток Е. coli по отношению к нормированному исходному распределению данных клеток в процессе их культивирования в течение 4 часов; кривая 3 - нормированное распределение бактерийных клеток Е. coli по отношению к нормированному исходному распределению данных клеток в процессе их культивирования в течение 5 часов, кривая 4 - нормированное распределение бактерийных клеток Е. coli по отношению к нормированному исходному распределению данных клеток в процессе их культивирования в течение 6 часов. С полученных результатов видим, что численность бактерийных клеток Е. coli в процессе культивирования по отношению на начало процесса на момент времени 6 часов для клеток размерами 0,5 мкм выросла в 3 раза, размерами 0,6 мкм выросла в 7 раз, размерами 0,7 мкм выросла в 11,2 раз.

Пример 5

Проведение исследований клеток гриба Mucor racemosus в жидкой питательной среде Сабуро согласно требованиям. Для этого навески сухого ферментативного пептона 10,0 г, глюкозы 10,0 г вносят в колбу со 1 литром деионизированной воды, устанавливая таким образом рН, чтобы после стерилизации его значение составляло 5,6±0,2. Среду фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,2 мкм, стерилизуют в паровом стерилизаторе при 121°С в течение 15 минут. В среду вносят клетки гриба Mucor racemosus из расчета, чтобы исходная концентрация составляла 10000 клеток/мл питательной среды. Подготовленный таким образом раствор исследуемых клеток разливают в стерильные пробирки емкостью 5 см³, закрывают их ватно-марлевыми пробками, и инкубируют в термостате при 25°С. Замеры интенсивности рассеянного частицами света в исследуемых образцах проводят в интервалы времени 7, 20, 42 после начала инкубации. При этом предварительно проводят подготовка пробы, которая состоит в следующем. Содержимое каждой пробирки разводят в соотношении 1:100 в стерильном 5% растворе глюкозы в сосуде емкостью 200 см³, герметически закрытом резиновой пробкой с алюминиевым ободом. Полученную таким образом пробу исследуемых клеток гриба набирают стерильным шприцем емкостью 20 см³, помещают в шприцевой насос, и проводят замеры изменения интенсивности рассеяния света частицами на устройстве, описанном в Патенте на изобретение Украины №49164С от 10.09.2003. Способ и устройство для определения распределения размеров взвешенных частиц в потоке жидкости. Устройство предварительно калибруют по сферическим полистирольным латексам с показателем преломления n=1,56. Замеры каждой пробы проводят 5-6 раз с дальнейшим статистическим анализом результатов измерений. Между измерениями каждой пробы гидравлический тракт и оптическую кювету устройства промывают деионизированной водой. Для выбранного числа измерений s и доверительной вероятности Р=0,95 определяют коэффициент Стьюдента и границы доверительного интервала относительно среднего значения согласно формуле (5). Результаты замера относительного содержания частиц - гриба Mucor racemosus и продуктов распада питательной среды Сабуро в 5% растворе глюкозы на 2 сутки культивирования в интервале размеров 0,2-2,0 мкм показаны на фиг.9. С приведенных результатов видно, что на 2 сутки инкубации клеток гриба Mucor racemosus на кривой размерного распределения наблюдается полоса с четко выделенным максимумом при 0,33 мкм и слабо интенсивным хвостом в интервале размеров 0,7-1,9 мкм.

Для определения количества микробиологических объектов в процессе их культивирования используют измерения их морфологического состава путем определения размерного распределения клеток микроорганизмов в жидкой питательной среде по изменениям интенсивности рассеянного ими света. Проводят зондирование потока жидкости монохроматическим когерентным светом, регистрацию сигналов взаимодействия зондирующего излучения с исследуемыми микробиологическими объектами путем измерения амплитуды и длительности импульсов рассеиваемого света исследуемыми частицами и построением по результатам измерения функций в виде двухмерного распределения нормированным значениям амплитуд и длительностей, выражающие статистические параметры интенсивности рассеяния света частицами. За данными функциями получают размерное распределение исследуемых микробиологических объектов и продуктов распада жидкой питательной среды в процессе их культивирования. Это обеспечивает повышение точности измерений за счет исключения погрешности, обусловленной появлением посторонних частиц - продуктов распада питательной среды в процессе культивирования исследуемых микробиологических объектов. 9 ил.

Способ определения количества микробиологических объектов в процессе их культивирования, который включает подачу потока жидкости с постоянной скоростью, содержащий исследуемые объекты, зондирование потока жидкости с помощью когерентного монохроматического оптического излучения, калибровку путем построения двухмерного распределения регистрированных импульсов в заданном объеме от сферических частиц с известным показателем преломления радиуса r в виде функции K(U,t,r) по значениям нормированных амплитуд U, и длительностей t импульсов рассеянного излучения, зондирование потока жидкости с исследуемыми объектами тем же монохроматическим когерентным светом и в том же объеме, в котором проводится калибровка, регистрацию импульсов рассеянного света от зондирующих частиц под заданным углом в интервале от 1 до 360°, определение функции n(r) размерного распределения исследуемых частиц путем регистрации импульсов от зондирующих частиц, сортировки регистрированных импульсов для построения двухмерного распределения их амплитуд и длительностей в поддиапазонах с границами, как в случае зондирования частиц, выбранных для калибровки, нормировки численных значений величин амплитуды и длительности импульсов в каждом поддиапазоне, построения по нормированным значениям функции вида F(U,t), определяющая размерное распределение исследуемых объектов в интервале размеров от r_min до r_max как:

отличающийся тем, что отобранные для исследований микробиологические объекты культивируют в жидкой питательной среде, определяют временные зависимости изменения численности микробиологических объектов и фоновых частиц в той же среде, для этого исследуемую жидкую питательную среду с микробиологическими объектами и без них разводят в равных пропорциях в одной из высокочистых жидкостях: физиологический раствор хлорида натрия, 5%-ный раствор глюкозы или деионизированная вода, отдельно определяют общее размерное распределение микробиологических объектов и фоновых частиц в высокочистой жидкости, которая содержит микробиологические объекты, и общее размерное распределение фоновых частиц в высокочистой жидкости, в которой микробиологические объекты отсутствуют, определяют численное значение микробиологических объектов в заданном интервале размеров путем расчета количества частиц в питательной среде с клетками и без них, определяют относительное содержание микробиологических объектов в заданном интервале размеров путем расчета отношения доли микробиологических объектов в заданном интервале размеров к общему количеству микробиологических объектов, строят временные зависимости изменений количества микробиологических объектов и их относительного содержания в заданном интервале размеров в процессе культивирования.