Способ моделирования функциональных сдвигов ультраструктур клетки Советский патент 1987 года по МПК G01N33/49 

1

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для исследования молекулярных механизмов стресса.

Целью изобретения является воспроизведение стрессорно-обусловленных сдвигов.

Определяют концентрацию катехола- минов, глюкокортикоидов и липоцроте- идов различных классов в крови стрес- сированных животных, добавляя затем в среду в качестве адаптивных гормонов глюкокортикоиды и адреналин и

один из классов липе/протеидов в кон- 15 Данные сравнивают с результатами анацентрациях,

in vivo. .

соответствующих модели

Пример. Моделируют внутриклеточные метаболические и ультраструктурные изменения, характерные для стресса, вызванного физической нагрузкой. Этот вариант стресса характеризуется значительным увеличением глюкокортикоидов и адреналина Б крови, увеличением количества лнпо- протеидов в сыворотке крови и сдвигом липопротеидного спектра в сторону преобладания липопротеидов выссз-- кой плотности (ЛПВП) (табл. 1).

Срезы печени крысы помещают в Кребс-Рингер-Бикарбонатный буфер. Инкубационную среду продувают газовой смесью, содержащей 95% 0 и 5% COj. Инкубагщю производят в закрытых колбах объемом 10 мл при 37 С при постоянном покачивании в течение 30 мин 1 или 2 ч. Перед началом инкубации к срезам добавляют адреналин, гидрокортизон и липопротеиды высокой плотности. 0,1%-ный раствор адреналина разводят физиологическим раствором в 100 раз и добавляют к инкубируемым срезам из расчета 0,1 мл/5 мл среды. Конечная концентрация адреналина . Гидрокортизон растворяют в диметилсульфоксиде (З мг/мл) и разводят в 100 раз физиологическим раствором. Полученный раствор добавляют к срезам из расчета 0,1 мг/1 мл среды. Конечная концентрация гидрокортизона в среде . Липопротеиды добавляют по 0,1 мг белка/1 мл среды.

После окончания инкубации срезы отмывают от среды холодным физиологическим раствором и в дальнейшем исп пользуют для оценки состояния метаболизма и ультраструктур печеночных клеток. Инкубация срезов в указанной

32852

среде в течение 3 ч не сопровождалась потерей растворимого белка, а также снижением активности ключевых фер- J ментов гликолиза и гликогенолиза, что свидетельствует о хорошем сохранении жизнеспособности тканевых ере- зов.

В печеночных срезах исследуют , 1Q функциональное состояние лизосомаль- ного аппарата, скорость биосинтетических процессов, активность ферментов пентозофосфатного пути и некоторые другие показатели. Полученные

логичных исследований, проведенных на печени крыс, у которых стресс вызывали интенсивной физической нагрузкой (плавание в течение 3,5 ч с грузом, составляющим А% от массы тела, Мри температуре воды 32-ЗА°С).

Биохимическими и гистохимическими методами показана полная идентичность

изменений лизосомного аппарата печеночных срезов, инкубированных в течение 30 мин в присутствии гидрокортизона, адреналина и сывороточных липопротеидов высокой плотности, том

изменениям, которые наблюдаются в печени животных, стрессированных интенсивной физической нагрузкой. В обоих случаях наблюдают повышение свободной активности лизосомных ферментов, снижение сомотической устойчивости лизосом, транслокацию лизосом в околоядерное пространство и повышение активности лизосомньгх ферментов в ядрах гепатоцилов. Этого не удавалось получить, если из инкубационной среды исключали ЛПВП.

Так же, как и при физической нагрузке, 2-часовая инкубация печеночных срезов с гидрокортизоном, адреналином и ЛПВП сопровождается резкой активацией биосинтетических процессов. При этом более, чем в 2,5 раза возрастает скорость включения аминокислот в растворимый белок печени и Н-уряцина в РНК, в 1,5 раза увеличивается скорость синтеза липо- протеидои низкой и очень низкой плотности в гепатоцитах, возрастает активность ключевого фермента пентозофосфатного - глюкозо-6-фосфат- дегидрогеназы (табл. 2). Все эти явления не наблюдались или бьши выражены в 2-А раза меньше, чем в инкубационную среду добавляли лишь

3134

один гидрокортизон или один адреналин, или гидрокортизон с адреналином..

Формула изобретения

Способ моделирования функциональных сдвигов ультраструктур клетки путем перфузии органа или инкубации тканевых срезов в среде, содержащей адаптивные гормоны, отличающийся тем, что, с целью воеУсловия опытов ЛПОНП, % ЛПНП, % ЛПВП, % Суммарная

фракция ЛПОНП и ЛПНП, мг/л

Интактные животные 0,,0020,,0050,,005 7,,62 (контроль) (10) 14 5925

Плавание 3,5 ч (12) 0,,0020,091+0,0030,,006 5,,53

15 5035

Достоверное отличие от контроля (Р 0,05), ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности, ШШП - липопротеиды низкой плотности; ЛПВП - липопротеиды высокой плотности; концентрацию липопротеидов в крови определяют электрофоре- тическим методом.

Таблица 2

Условия опытов Свободная активность, % отГ-6-ФДГ, Включение метки

общей активности ферментовнмоль/г бел- в белок

ка за 1 мин

Кат.Д

Контроль (интактные животные)

(22)ll,5jfO,90 20,,90 26,,88 1572jfl33

Плавание (18) 21, ljKl,72 33,6jf2,50 34,, 3609+ 287

Контроль (срезы

без добавок) (1b)

ГК+А-ьЛПВП ( 3) 25,7jb2,27 38,8+2,8 30,,82 3923+400

Р 0,05. Р 0,0 по отношению к контролю: КФ - кислая фосфатаза; Кат.Д - катепсин Д; Г-6-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; ГК+А+ЛПВП - гидрокортизон + адреналин + липопротеиды высокой плотности.

ВНИИПИ Заказ 4815/43 Тираж 776

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5

произведения стрессорно-обуслов.пенных сдвигов, предварительно определяйт концентрации катехоламинов , глюкокор- тикоидов и липопротеидов различных классов в крови стрессированных животных, после чего инкубируют срезы в среде, содержащей в качестве адаптивных гормонов глюкокортикоиды и адреналин и один из классов липопротеидов в концентрациях, соответствующих модели in vivo.

Таблица 1

Подписное

Изобретение относится к экспериментальной медицине. Цель изобретения - воспроизведение стрессорно- обусловленных сдвигов. Определяют концентрацию катехоламинов, глюкокор- тикоидов и липопротеидов в крови животных после воздействия стресса. Инкубируют тканевые срезы в среде , включающей глюкокортикоиды, адреналин и один из классов липопротеидов. При этом наблюдают повьппение свободной актив1ности лизосомных ферментов, траслокацию лизосом в околоядерное пространство и снижение соматической устойчивости лизосом. 2 табл. i (Л с 4 00 to 00 СП