Способ получения очищенного белка а золотистого стафилококка Советский патент 1987 года по МПК A61K39/85 

1

получению

Изобретение относится бактериальных препаратов.

Целью изобретения является повышение выхода, биологической активности белка А и чистоты.

Пример 1. Золотистый стафилококк А-676 культивируют в реакторе для выращивания бактерийных культур на пептонно-дрожже- вой питательной среде. Продолжительность выращивания 12 ч при 38-40°С, перемешивание со скоростью 300-500 об/мин и продувание стерильного воздуха через питательную среду в количестве 30 м /мин.

Культуру прогревают по окончании выращивания непосредственно в реакторе при 80°С 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры и освобождают от микробной массы центрофугированием при 3 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочный слой контролируют на активность белка А в реакции непрямой гамагглютинации с эритроцитами, нагруженными IgG человека. Для выведения белка А используют надоса- дочную жидкость (сырье) с титром не ниже чем 1:2560 в РИГА. До использования в операциях очистки сырье хранят при -20°С.

Приготовление аффинного сорбента. Выделение IgG из сыворотки свиней. Свиную сыворотку, полученную на мясокомбинате в день убоя животных, в тот же день используют для выделения IgG. К 500 мл сыворотки добавляют 500 мл дистиллированной воды и при постоянном перемешивании 666 мл насыщенного раствора (NH4)2S04. Через 18-20 ч выстаивания при комнатной температуре смесь центрифугируют, надоса- док удаляют, осадок растворяют в 150 мл 0,15 М раствора хлорида натрия и диализуют в течение 48 ч против 5 смен 0,02 М фосфатного буферного раствора, рН 7,0±0,1 (по 5 л на каждую смену). Получают свободный от сернокислого аммония раствор суммарной глобулиновой фракции в объеме 200-250 мл.

Этот раствор со скоростью 500 мл/ч пропускают через колонку с молселектом ДЕАЕ А-50 (диаметром 5 см при высоте слоя геля 95 см), предварительно уравновешенную 0,02 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0±0,1). Этот же буфер пропускают через колонку после вхождения раствора белка в гель, фракцию белка, элюирующуюся в данном буфере, собирают. Получают 3-3,5 г IgG в объеме 800-1100 мл буфера.

Приготовление иммуносорбента для очистки IgG от антител к стафилококковым антигенам.

2 л А-белоксодержащего сырья пропускают через колонку с аффинным сорбентом, при этом получают 2 л жидкости, свободной от белка А, но содержащей прочие экстра- целлюлярные белки стафилококка. Жидкость концентрируют на ячейке ФМ-02 с фильтром Рипор-4 до объема 50 мл, диализуют против 2 л 0,1 М раствора фосфата натрия двузамещенного и полученный концентрат белков иммобилизуют на 50 мл геля CNBr-активированной агарозы, используя все рабочие растворы в полном объеме. Готовый иммуносорбент упаковывают в хроматогра- фическую колонку диаметром 3 см и высотой 10 см.

Приготовление иммобилизованного ово- мукоида.

1 г коммерческого овомукоида растворяют в 50 мл 0,1 М раствора Na2HP04 и иммобилизуют на 50 мл CNBr-активированной агарозы. Готовый сорбент упаковывают в колонку диаметром 3 см и высотой 10 см.

Очистка IgG свиньи на иммуносорбенте и иммобилизованном ингибиторе протеаз.

Раствор IgG свиньи со скоростью 100 мл/ч при 4°С пропускают последовательно через колонки с иммобилизованными экстра- целлюлярными белками стафилококка и иммобилизованным овомукоидом, предварительно уравновешивая колонки 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,2±0,2) на 0,15 М растворе хлорида натрия (ЗФР). Затем полученный раствор IgG концентрируют до объема 100 мл на ячейке ФМ-02 с фильтром Рипор-3.

Иммобилизация IgG свиньи на CNBr-активированной агарозе.

30 г коммерческой CNBr-активированной агарозы (производства Института химиии АН ЭССР) промывают на фильтре Шотта 5 л воды, затем гель переносят в пластмассовый сосуд емкостью 0,5 л и добавляют к нему 50 мл 0,1 М двузамещенного фосфата натрия и 100 мл раствора очищенного IgG свиньи, компоненты быстро перемешивают и инкубируют при мягком перемешивании 2 ч при 18-22°С и 16 ч при 4°С. После этого гель переносят на фильтр Шотта, промывают 2 л 0,1 М двузамещенного фосфата натрия и 2 ч инкубируют с 200 мл 0,5 М раствора г.пицина. Затем гель промывают 2 л ЗФР, 2 л 1 М раствора хлорида натрия, 2 л 0,1 М глицинового буферного раствора (рН 3,0). Указанный цикл промьпвок повторяют еще 2 раза и гель переносят в колонку диаметром 4 см и промывают 5 л ЗФР на свободном протоке.

Затем колонку промывают 1 л ЗФР с мертиолатом в конечной концентрации 1:10000 и хранят с этим раствором до использования при 4°С.

Очистка белка А.

А-белоксодержащее сырье, имеющее титр белка А 1:5120 в РИГА, осветляют на асбестовой пластине типа Ф и при 4°С пропускают через колонку с аффинным сорбентом, приготовленным из IgG свиньи, очищенным иммуносорбцией от антител к белкам стафилококка и от протеаз. Скорость процесса поддерживают на уровне 1500 мл/ч. Вытекающий раствор собирают фракциями по 1 л и контролируют в РНГП на активность белка А. Выход фракции вытекающего раствора с титром белка А 1:320 (1/16 исходного титра) наблюдают после прохождения через колонку 24 л сырья и после этого пропускание сырья прекращают. Аффинный сорбент промывают 10 л 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,2 ±0,2) на 0,3 М растворе NaCl при скорости 2 л/ч.

Затем через колонку пропускают 0,1 н. НС1-ГЛИЦИНОВЫЙ буфер (рН 3,0) при скорости 200 мл/ч, элюцию белка регистрируют ультрафиолетовым асорбциометром при длине волны 280 нм. По выхождении пика белка сбор вытекающего раствора прекращают и белоксодержащую фракцию нейтрализуют 0,5 н. NaOH при постоянном перемешивании раствора под контролем рН-метра до рН 7,2±0,2. Получают 42,8 мл раствора белка, содержащего 214 мг очищенного белка А с титром в РИГА 1:2560000.

Полученный продукт дает отрицательную реакцию на присутствие стафилококковых токсинов в РИГА с антительным эритроци- тарным диагностикумом при их титре в исходном материале 1:2560.

Электрофоретически в 7%-ном полиак- риламидном геле в продукте очистки определяется одна узкая зона белка, соответствующая белку А по подвижности в электрическом поле. По сравнению с известным белком, полученным из того же исходного сырья, имеются существенные преимущества: выход активности белка А увеличен на 23%, удельная активность возросла более чем на 25%, полученный белок А более гомогенен, о чем свидетельствует малая ширина фракции при электрофорезе в полиакриамидном геле. Полученный по предлагаемому способу белок А свободен от стафилококковых токсинов.

Пример 2. Выделение белка А производят в точном соответствии с примером 1 с тем

отличаем, что сырье пропускают через аффинный сорбент до выхода фракции вытекающего раствора с активностью белка А в титре 1:2560 (1/2 исходного титра), расходуя при этом 59 л сырья. В результате более высокой степени насыщения сорбента почти вдвое увеличивают выход массы и активности белка А в одном цикле при таких же параметрах качества, как в примере 1. Потери, наблюдаемые на стадии пропускания через аффинный сорбент, обратимы, так как остаточные количества белка А в вытекающем растворе (27% по активности) могут быть выделены в последующих циклах хроматографии. Выход активности по отношению к сорбированному количеству равен 93%. Таким образом, необратимые потери активности в ходе очистки равны 7%. В известном способе при той же степени насыщения аффинного сорбента (до выхода фракции вытекающего раствора с титром белка А 1:2560) потери выше на 24%. Предлагаемый способ обеспечивает очистку от стафилококковых токсинов.

Пример 3. Выделение белка А проводят, как в примере 1, с тем отличием, что для изготовления аффинного сорбента применяют IgG человека, который выделяют, очищают от антител к стафилококковым белкам и иммобилизуют на CNBr-активированной ага- розе в точном соответствии с примером 1, используя такие же объемы реагентов и концентрации раствора.

Через колонку с аффинным сорбентом пропускают 12 л исходного сырья с активностью белка А 1:5120 в РИГА. Элюированный глициновым буферным раствором (рН 3,0) белок А нейтрализуют. Получают 43 мл раствора белка А с активностью в титре 1:1280000 в РПГА при концентрации белка 2,57 мг/мл. Выход активности и удельная активность конечного продукта на 20% выше, чем в известном способе. Предлагаемый способ дает высокогомогенный белок А, свободный от стафилококковых токсинов.

В порядке экспериментального обоснования эффективности предлагаемых технических решений выполняют способы выделения белка А с различными вариантами сорбентов и разными температурами прогревания сырья. Аффинный сорбент из неочищенных от противостафилококковых антител IgG свиньи, белка и человека не обеспечивает получения высокогомогенного белка А без примеси токсинов.

При изготовлении аффинного сорбента из IgG свиньи, очищенного только от антител к стафилококковым антигенам, достигают

некоторое повышение выхода активности, улучшение гомогенности целевого продукта и очистку от токсинов.

Введение операции очистки IgG для аффинного сорбента от протеолитических ферментов дает эффект существенного улучшения гомогенности, повышения биологической активности и выхода целевого продукта по активности.

Максимальный эффект по выходу, гомогенности и очистке от токсинов дает применение аффинного сорбента из IgG, предварительного очищенного от антител к стафилококку и протеолитических ферментов, в сочетании с прогреванием исходного сырья в интервале температур 80-90° С.

Меньшие температуры (70°С) и более высокие (90°С) не обеспечивают оптимального эффекта.

Представленные материалы показывают, что максимального выхода белка А по массе достигают при использовании IgG высокореагирующих видов (человека, свиньи) для приготовления аффинного сорбента. Применение для этих целей IgG низкореагирующего вида, IgG быка, дает минимальную

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения очищенного белка А золотистого стафилококка, включающий приготовление аффинного сорбента путем иммобилизации иммуноглобу.гашов класса G млекопитающих на нерастворимом корпускулярном носителе, контактирование исходного сырья с аффинным сорбентом, промывку сорбента от примесей и элюцию белка А, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода продукта, биологической активности белка А и чистоты, аффинный сорбент готовят из нормальных сывороточных IgG свиньи или человека, причем перед иммобилизацией IgG его очищают от антител к экстрацеллюлярным антигенам стафилококка и от протеолитических ферментов, далее

производительность и низкий выход белка А по причине низкого сродства к Fc-фрагменту.

Применение предлагаемого способа создает следующие преимущества: более чем на 20% повышается выход биологической активности белка А за счет снижения необратимых потерь; целевой продукт имеет более высокие параметры качества - более высокую уде.лоьную биологическую активность (примерно на 25%) и высокую гомогенность; в очищенном белке А полностью отсутствуют стафилококковые токсины; применение IgG высокореагирующих с белком А видов обеспечивает высокопроизводительную технологию его получения.

Получение белка А более высокой активности, гомогенности с контролируемым отсутствием стафилококковых токсинов открывает возможности для более достоверного изучения его активности in vivo и для конструирования лечебных препаратов на его основе.

Для осуществления предлагаемого способа требуются дополнительные материалы и трудозатраты.

перед контактированием с аффинным сорбентом исходное сырье прогревают при 80 - 90°С 30 мин.

2.Способ по П.1, отличающийся тем, что для очистки IgG от антител к экстрацеллюлярным антигенам стафилококка используют иммуносорбент с иммобилизованными концентрированными растворимыми компонентами культуры штамма-продуцента, предварительно очищенными от белка А.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что для очистки IgG от протеолитических ферментов используют аффинный сорбент с иммобилизованным овомукоидом.

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - повышение выхоа 40 iTi го чо го р 00 да продукта биологической активности белка А и его чистоты. Из нормальных сывороточных иммуноглобулинов класса G готовят аффинный сорбент. Пропускают белоксодержащее сырье через колонку с сорбентом. Полученный раствор собирают фракциями и контролируют активность белка А. Выход активности белка А увеличивается на 23%. Полученный белок А более гомогенен и свободен от стафилококковых токсинов. 2 3. п. ф-лы. ел с ы ON U и о VO