СПОСОБ ОЧИСТКИ АССОЦИИРОВАННОГО С БЕРЕМЕННОСТЬЮ ПРОТЕИНА А Советский патент 1996 года по МПК A61K38/02 G01N33/53 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в промышленном производстве ассоциированного с беременностью протеина А.

Цель повышение выхода и чистоты.

П р и м е р 1. 150 мл плазмы крови беременных женщин соединяют с 150 мл лизин-агарозы и встряхивают в течение 1 ч. Затем плазму отделяют от сорбента на стеклянном фильтре. В качестве уравновешивающего буфера для лизин-агарозы применяют забуференный фосфатами физиологический раствор, рН 7,2 (ЗФР). К полученному объему плазмы приливают такой же объем 0,05 М трис-НС1 буфера, рН 7,8, и пропускают эту смесь через колонку (2,0•16 см), объемом 50 мл. Гепарин-агарозу предварительно синтезируют из гепарина ("Spofa", Чехословакия) и BrCN-активизированной агарозы ("Кемотекс"). Полученный сорбент содержит 310 мкг гепарина в перерасчете на 1 л влажного геля. Взаимодействие сорбента с плазмой осуществляют при скорости подвижной фазы 20 мл/ч. Затем колонку отмывают стартовым буфером без тритона Х-100 под контролем спектрофотометра ( Е 280 нм). Белок элюируют 0,05M трис-HC1 буфером, рН 7,8, содержащем 1 М хлористого натрия. Белоксодержащие фракции собирают и наносят их на колонку (10 мл) ОЭСАА-агарозы с иммобилизованными антителами против белков сыворотки крови человека, уравновешанную ЗФР, и проводят хроматографию со скоростью подвижной фазы 0,5 мл/ч.

Для синтеза антительного сорбента ОЭСАА-агарозу ("Кемотекс") смешивают с соляной кислотой до ее конечной концентрации 5% (в ледяной бане). К смеси при охлаждении и постоянном помешивании добавляют азотистокислый натрий до конечной концентрации 2% После растворения азотистокислого натрия смесь встряхивают 30 мин в тех же условиях. Диазотированное производное промывают на стеклянном фильтре 0,1 М боратным буфером с рН 8,6 и смешивают с 2% (по содержанию белка) сывороткой крови мужчин-доноров, растворенной в том же буфере. Смесь встряхивают 2 ч при комнатной температуре. Несвязанный белок отмывают 0,02 М глицин-солянокислым буфером, рН 2,8, и в заключение ЗФР. Готовый сорбент используют для извлечения антител против белков сыворотки крови человека из козьей антисыворотки против них. Антитела элюируют указанным кислым буфером, затем диализуют их против 0,1 М боратного буфера, рН 8,6, и концентрируют с помощью диализа против полиэтиленгликоля-40000 ("Merck", ФРГ) до содержания белка 2% Концентрат им мобилизуют на ОЭСАА-агарозе описанным способом. Прошедшие через антительный сорбент белоксодержащие фракции (E= 280 им) хранят при температурах 20 и -70^oС. Все манипуляции при очистке белка проводят при 4^oС.

С целью проверки чистоты БАБА проводят зональный электрофорез в градиенте пор полиакриламидного геля,изоэлектрофокусирование в амфолитном градиенте рН, иммуноэлектрофорез как с антисывороткой против БАБА, так и против белков сыворотки крови человека. По данным зонального электрофореза примесные белки в препарате БАБА отсутствуют, а его молекулярная масса равняется 820 Кда. По данным изоэлект рофокусирования в препарате БАБА находится единственный протеин, имеющий изоэлектрическую точку 4, 6, а белки с иными изоточками не обнаруживаются. При иммуноэлектрофорезе с антисывороткой против БАБА в зоне глобулинов с альфа-электрофоретической подвижностью определяется единственный иммунопреципитат БАБА, а при использовании антисыворотки против белков сыворотки крови человека какие-либо иммунопреципитаты отсутствуют. Таким образом, препарат БАБА имеет высокую степень очистки.

С целью проверки активности белка в функциональных тестах с ферментами инкубируют БАБА с трипсином, плазмином, колагеназой и эластазой гранулоцитов ("Sigma", США) в эквимолярных соотношениях в течение 30 мин при 37^oС. Затем вносят различные субстраты: азоказеин и азофибрин ("Диагностикум") для трипсина и плазмина, ОГП-0 (НПО "Фермент") для коллагеназы и эластазы. Белок подавляет протеолитическую активность трипсина на 80,5% плазмина на 66,7% коллагеназы на 78,7% эластазы на 92,4% Таким образом, в ходе очистки не изменяются физико-химические, антигенные и функциональные свойства БАБА.

Сравнение выхода целевого продукта по прототипу и предлагаемому способам приведено в таблице. ТТТ1

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в промышленном производстве ассоциированного с беременностью протеина А. Цель - повышение выхода и чистоты. Плазму крови беременных женщин последовательно подвергают аффинной хроматографии на лизин - агарозе, аффинной хроматографии на гепарин-агарозе без поперечной сшивки, а затем иммуноаффинной хроматографии на 4-бета-оксиэтилсульфонил-2-аминоанизол-агарозе с иммобилизованными антителами против белков сыворотки крови мужчин. Выход 38,0±0,7%, а степень чистоты 98,0± 0,3%. 1 табл.

Способ очистки ассоциированного с беременностью протеина А путем последовательного хроматографирования фракции крови беременных женщин на гельсорбентах с использованием гепаринагарозы, иммуноаффинной хроматографии на активированной агарозе с иммобилизованными антителами против белков сыворотки крови мужчин, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, плазму крови подвергают аффинной хроматографии на лизин-агарозе, затем аффинной хроматографии на гепарин агарозе без поперечной сшивки, а для иммуноаффинной хроматографии используют 4-бета-оксиэтил-сульфонил-2-аминоанизол-агарозу.