Способ получения реагента для типирования антигенов эритроцитов Советский патент 1992 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к медицине и касается способов получения реагентов, используемых для типирования антигенов эритроцитов.

Реагенты для определения групп крови возможно готовить из фракций антител, выделенных из цельных сывороток методом аффинной хроматографии. Очищенный антигены А и В, выделенные из кисты яичника человека, иммобилизуют на Сефарозе 2В, активированной бромцианом. Через колонку с антигеном пропускают сырье АВЩ специфичности и сорбируют соответствующие антитела. Элюцию антител осуществляют трифлуорбацетатом вфосфатном буферном растворе (рН 7,2-7,4). Полученные фракции антител стабилизируют путем диализа в течение 18 часов против ФБР (рН 7,2) с добавлением хлорида натрия.

Описанный метод имеет ряд существенных недостатков: 1. В качестве активных центров сорбента используют А и В антигены человека, при взаимодействии с антителами образуется сильная ковалентная связь, выход конечного продукта после сорбции низок (до 10 % от исходной). 2. Элюцию антител осуществляют только при использовании хаотропных ионов (трифлуо- роацетата), что оказывает отрицательное воздействие на очищенные антитела, снижая их стабильность.

Цель изобретения: повышение выхода целевого продукта и упрощение способа его получения.

Указанная цель достигается путем аффинной хроматографии АВО сырья на агарозе, активированной бромцианом, коньюгированной с антигенами А и В-подо- бными животного происхождения при сорбVJ

00 О 1 СП

о

ции антител со скоростью 50 мл/ч х см и элюции их цитратно-фосфатным буферным раствором (рН 2,0-2,5) со скоростью 10 мл/ч х см2.

Предлагаемый способ фракционирования осуществляется следующим образом: выделяют фруглумин А и В путем ферментативного переваривания слизистых желудков свиньи и лошади. Иммобилизуют антигены на цианбромактивированной ага- розе, для чего агарозу суспендируют в рас--; творе CNBr и смесь уравновешивают в течение 10 мин, в процессе активации рН поддерживают на уровне 11,0 добавлением ЗМ гидроокиси натрия. Активированный г ель немёдл е н но отм ы вают дйстимирюван: ной водой, затем 0,5 М раствором NaHCOa при рН 8,5. А и В вещество в концентраций Гмг/мл добавляют и выдерживают на роторной мешалке в течение 18ч. Аминокар- бонатныё группы блокируют 0,5 М раствором глицина на ФБР. Для оценки эффективности связывания антигенов с носителем контролируют концентрацию белка в исходном растворе антигена и во всех пробах промывной жидкости, полученных в процессе иммобилизации. После иммобилизаций сорбент помещают в колонку. Объ ем колонки составляет 8 мм , объем сорбента -1 мм3. Иммуносорбент используют многократно (10-20 раз) без потери специфической активности для сорбции соответствующих антител из сырья, объем которого в 10 раз превышает объем сорбента. Оптимально проводить сорбцию антител ; из сыворотки со скоростью 40-60 мл/ч х см2 Элюцию антител с колонки бсуществля- ют цитратно-фосфатным буфе рным раствором при рН 2,0-2,5 и скорости 7-12 мл/ч х см2.

Примеры ко нкретного осуществления способа:

Пример 1. В материалах зШв ки, где скорость сорбции - 50 мл/часхсм2, скорость элюции - 10 мл/ч хсм2.

Пример 2. Получали фракцию анти-В

антител Us гипериммунной сыворотки крови

барана, иммунизированного эритроцитами

человека группы крови В. Титр антител в

исходном сырье составлял: анти-В - 1 :

1, гетероантител - 1 : 256. Объем сыво- си - 10 мл, объем сорбента - 1 мм .

1024, ротки

Колонку с сорбентом промывали 10 объемами ФБР (рН 7,2), затем пропускали сыворотку со скоростью 40 мл/ч х см Элюцию сорбированных антител проводили ЦФБ (рН 2,5) со скоростью 7 мл/час х см2 Объем фракций сорбировнных антител составлял 2 мл. Фракции нейтрализовали 0,5 и раствором гидроокиси натрия. Титр специфиче- ских антител составлял 1.: 1024-1 : 2048. Гетероантитела в полученных фракциях от- сутствовали..

Пример 3. Получали фракцию анти-А

антител из гйпериммунной сыворотки крови кролика, иммунизированного эритроцитами челрвека группы А. Титр антител в исходном сырье составлял: анти - А 1 : 2048, гетероантител - 1 : 1024. Обём сыво|эотки

был равен 10 мл, объем сорбента - 1 мм3. Колонку с сорбентом промывали 10 объемами ФБР (рН 7,2), затем пропускали сыворотку со скоростью 60 мл/ч х см . Элюцию сорбированных антител проводили ЦФБ

(рН 2,5) со скоростью 12 мл/ч х см2. Объема фракций элюированных антител составлял 2 мл. Пробы нейтрализовали 0,5 н раствором

гидроокиси натрия. Титр специфичных анти-А антител во фракциях составлял 1 :

1024. Гетероантитела в полученных фракциях отсутствовали.

Формула изобретения Способ получения реагента для типирования антигенов эритроцитов путем аффинной хроматографии;) сырья АВО спёцифичнбб™ на агарозе, активированной бромцианом и конъюгированной с антигенами А и В специфичности, сорбции антител

из сыворотки с последующей их элюцией с сорбента буферным раствором, от л и ч а ю- щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, в качестве антигенов Аи В специфичности используют фруглумин А и В, выделенный из слизистой оболочки желудка животных, сорбцию антител проводят со скоростью 50 мл/ч х см2, а элюцию осуществляют цитратно-фосфатным буферным

раствором при рН 2,0-2,5 со скоростью 10 мл/ч х см . .