СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИННОГО СОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ИЗ РАСТВОРОВ И БИОСУБСТРАТОВ Российский патент 2002 года по МПК A61K39/395 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в разработке новых средств лечения заболеваний, вызванных массивным поступлением фактора некроза опухоли (TNF) во внутреннюю среду организма, например, септическом шоке.

TNF, при его высоких концентрациях в крови ответственен за целый ряд патологических процессов: гипотензию, гранулоцитопению, истощение энергетических запасов клеток, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови и т.д.

Разработаны аффинные сорбенты для удаления фактора некроза опухоли из растворов и биосубстратов, которые основаны на принципе иммобилизации на твердой фазе селективных лигандов для связывания TNF [1, 2].

Наиболее близок по существу к предлагаемому изобретению способ [1]. Аффинный сорбент для удаления TNF получают путем иммобилизации сывороточного α₂-макроглобулина на твердом носителе, а затем обрабатывают модификатором тиол-эфирной петли - монометиламином или плазмином крови человека.

Указанный способ, как и описанные выше аналоги, обладает заметной способностью связывать факторы системы комплемента [3, 4]. В условиях плазмо- и гемосорбции этот недостаток особенно нежелателен, так как способность активировать систему комплемента приводит к повышенной реактогенности процедуры плазмо- и гемосорбции in vivo.

Изобретение направлено на разработку способа получения аффинного сорбента для удаления фактора некроза опухоли из растворов и биосубстратов, при этом обеспечивается снижение антикомплементарности аффинного сорбента, повышение его селективности и специфической емкости для TNF.

Сущность изобретения сводится к следующему. Способ получения аффинного сорбента для удаления фактора некроза опухоли предусматривает иммобилизацию α₂-макроглобулина человека на твердом носителе с последующей обработкой модификатором тиолэфирной петли. Снижение антикомплементарности аффинного сорбента, повышение его селективности и специфической емкости для TNF обеспечивается за счет проведения дополнительной операции - обработки иммобилизованного α₂-макроглобулина N-ацетилнейраминовой кислотой (NANA), которую проводят после химического присоединения α₂-макроглобулина к носителю до операции блокировки остаточных активных групп носителя.

Способность активировать систему комплемента (антикомплементарность) присуща агарозе и сефарозе [3, 4] - самым "мягким носителям" для аффинных сорбентов. В специальной серии экспериментов нами установлено, что антикомплементарность свойственна в еще большей мере другим носителям - целлюлозе, макропористому стеклу, биогелю, актилену, сефадексу. Иммобилизация белков на этих носителях частично снижает, но не устраняет антикомплементарность носителя. Экспериментальная проверка показала, что иммобилизация известных лигандов для TNF-антител к нему и α₂-макроглобулина (до и после его модификации) не снижает, а напротив увеличивает примерно на 30% связывание активности комплемента на аффинном сорбенте. Причина этого явления остается невыясненной.

Оптимальные результаты получены, если раствор NANA для модификации берут в концентрации 0,5...1,2 мг/мл раствора.

Сущность и преимущества предлагаемого способа демонстрируют следующие примеры.

Пример 1.

α₂-Макроглобулин сыворотки крови человека в концентрации 1,5 мг по белку, приготовленный на 0,15 М фосфатном буферном растворе рН 7,0, содержащем 0,15 М NaСl, смешивают с равным объемом геля свежепромытой CNBr-сефарозы 4 В CL (Рhаrmасiа, Швеция). Смесь инкубируют 2 часа при 18-20^oС, а затем 16 часов при +4^oС при постоянном перемешивании на роторной мешалке со скоростью 2 оборота в минуту. Затем гель с иммобилизованным α₂-макроглобулином промывают на фильтре Шотта 0,5 М раствором NaСl на 0,15 М фосфатном буфере рН 7,0 (50 объемов промывочного раствора на 1 объем геля сефарозы). Промытый гель смешивают с равным объемом 0.15 М фосфатно-буферного раствора, содержащего 0,75 мг NANA в 1 мл (N-ацетилнейраминовая кислота очищенная кристаллическая для клеточных культур, фирмы Sigma). Смесь инкубируют при 20+5^oС 2 часа на роторной мешалке со скоростью вращения 2 об/мин, промывают на фильтре Шотта, как указано выше, контактируют 2 часа с равным объемом 0,5 М раствора глицина в 0,15 М фосфатном буферном растворе рН 7,2+0,1 с 0,5 М NaСl (для блокады непрореагировавших активных групп) и промывают на фильтре Шотта, попеременно пропуская через гель по 100 объемов буферных растворов: 0,1 М глицин-НСl буфера рН 3,0+0,1 и 0,15 М фосфатный буфер рН 7,2+0,1 с 0,5 М NaСl.

Дальнейшую обработку сорбента проводят после его упаковывания в хроматографическую колонку (2 мл геля сорбента в колонку диаметром 8 мм). Колонку подключают к перистальтическому насосу и многократно, по кругу, пропускают через нее 20 мл 0,5 М раствора монометиламина гидрохлорида в течение 30 минут при температуре 20+5^oС. Колонку отмывают от монометиламина, пропуская через нее 320 мл 0,15 М раствора NaСl с 0,01 М фосфатного буферного раствора рН 7,2+0,1 (забуферный физиологический раствор, ЗФР). Определяют связывающую емкость колонки в сравнении со связывающей емкостью прототипа. Для этой цели готовят ЗФР, содержащий 1000 ЕД TNF-2 в 1 мл (0,6 мкг/мл).Через каждую колонку пропускают по 2 мл раствора TNF со скоростью процесса 20 мл/час при 20+5^oС. В вытекающем растворе определяют остаточное количество TNF. Получают следующие результаты: в растворе, пропущенном через колонку, полученную предлагаемым способом, остаточное количество TNF 1800 ЕД. Пример демонстрирует, что модификация N-ацетилнейраминовой кислотой не снижает активность связывания TNF на сорбенте.

Пример 2.

Колонку, полученную в точном соответствии с описанными условиями в примере 1, используют для очистки от TNF плазмы гепаринизированной крови. Через колонку, содержащую 2 см³ геля сорбента, пропускают 10 мл плазмы крови, содержащей 50000 ЕД TNF. Измеряют остаточное количество TNF и получают данные о связывании на колонке существенно большего количества TNF, чем в случае прототипа (табл.1).

Пример 3.

Получают аффинный сорбент в точном соответствии с условиями, изложенными в примере 1.

Через колонку аффинного сорбента объемом 2 см³ геля пропускают свежеприготовленную сыворотку крови морской свинки в объеме 10 мл. Параллельно выполняют такую же операцию на колонке, полученной согласно прототипу. Определяют связывание колонками комплемента (значение выражают в ЕД активности комплемента).

Получают следующие результаты: прототип связывает 2560 ЕД активности на колонку, а сорбент по предлагаемому способу - 160 ЕД активности на колонку.

Антикомплементарность сорбента, полученного предлагаемым способом, в 16 раз ниже, чем антикомплементарность сорбента в прототипе.

Пример 4.

Приготовление сорбента выполняют в точном соответствии с примером 1 до операции упаковки в хроматографическую колонку включительно. После упаковки в колонку гель сорбента модифицируют плазмином, для чего через колонку в течение 30 минут рециркулируют ЗФР рН 7,2+0,1, содержащий 6 мл плазмина в 10 мл. После модификации колонку промывают ЗФР рН 7,2+0,1 (500 мл).

Полученный аффинный сорбент используют для связывания TNF. Для проверки работы сорбента в условиях высокой нагрузки используют большой избыток очищаемого субстрата. В качестве очищаемого биосубстрата используют сыворотку морской свинки в объеме 20 мл, в которую внесен TNF α₂ в количестве 80000 ЕД. Параллельно проводят операцию очистки такого же образца на аналогичной по размеру колонке-прототипе. Оценивают связывание TNF и антикомплементарности сорбентов. Получают следующие результаты: прототип связывает 59400 ЕД активности TNF и 3840 ЕД активности комплемента, а сорбент по предлагаемому способу связывает 70600 ЕД TNF и 200 ЕД активности комплемента.

Полученные результаты подтверждают эффективность предлагаемого способа в варианте с модификацией лиганда ферментом - плазмином. Сорбент, полученный предлагаемым способом, имеет более высокую связывающую емкость для TNF и многократно меньшую антикомплементарность.

Пример 5.

Выполняют, как указано в примере 1 с тем отличием, что обработку N-ацетилнейраминовой кислотой проводят после блокады глицином активных групп носителя - CNBr-агарозы. Получают сорбент с антикомплементарностью 2560 ЕД активности на колонку в условиях, аналогичных примеру 3, что не отличается от прототипа.

Остаточная концентрация TNF в биосубстрате, пропущенном через колонку прототипа, равна 1030 ЕД; в субстрате, очищенном на сорбенте по предложенному способу - 4700 ЕД.

Пример 6.

Получают сорбенты согласно примеру 1 с тем отличием, что N-ацетилнейраминовую кислоту для модификации сорбента используют в концентрациях соответственно: а) 0,3 мг/мл; б) 0,5 мг/мл; в) 0,7 мг/мл; г) 0,9 мг/мл; д) 1,1 мг/мл; е) 1.3 мг/мл.

Сорбенты используют для очистки от TNF и контроля антикомплементарности, как указано в примере 4.

Получают следующие результаты, приведенные в табл.2.

Существенный эффект снижения антикомплементарности обеспечивает концентрация N-ацетилнейраминовой кислоты 0,5 мг/мл и выше. Однако при концентрациях выше 1,1 мг/мл N-ацетилнейраминовой кислоты при модификации сорбента теряется другое преимущество очистки - прирост связывающей активности по отношению к TNF.

Источники информации
1. Патент РФ 2123860. Аффинный сорбент для удаления фактора некроза опухоли и способ его получения. - Опубл. 27.12.98, Бюл. 36.

2. Wilchek M., Mikon T., Kohn J. In: "Methods in Enzymology, Jakoly W.B. (ed), Academic Press, New York, vol. 104, p.3, 1984.

3. Пепис М.Б., Белл А. Дас., Роув И.Ф. В кн. "Иммуносорбенты в очистке белков". - M., Медицина, 1979, с.110-115.

4. Johnsson E., Eskeland Т. Scand. J. Inmunol, 1983, v.18, 2, p.169-179.

Изобретение относится к медицине. Проводят иммобилизацию α₂-макроглобулина на твердом носителе с последующей обработкой модификатором тиолэфирной петли. Иммобилизованный α₂-макроглобулин дополнительно обрабатывают N-ацетилнейраминовой кислотой перед блокадой непрореагировавших активных групп носителя. Оптимальные результаты получены при концентрации N-ацетилнейраминовой кислоты 0,5-1,2 мг/мл реагентной смеси. Изобретение позволяет снизить антикомплементарность и повысить сорбционную активность продукта. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения аффинного сорбента для удаления фактора некроза опухоли из растворов и биосубстратов, включающий иммобилизацию α₂-макроглобулина человека на твердом носителе с последующей обработкой модификатором тиолэфирной петли, отличающийся тем, что иммобилизованный α₂-макроглобулин обрабатывают дополнительно N-ацетилнейраминовой кислотой, причем обработку проводят до операции блокировки остаточных активных групп носителя глицином. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что N-ацетилнейраминовую кислоту берут в концентрации 0,5-1,2 мг/мл реагентной смеси.