Способ определения нелетучих биогенных аминов в пищевых продуктах Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

;о эо

1

Изобретение относится к пищевой промьшшенности и может быть использовано для определения микроколичеств нежелательных токсикантов в пищевых продуктах и биологических объектах.

Цель изобретения - повышение достоверности определения.

Способ заключается в тоМ, что при подщелачивании упаренного экстракта удаляются аммиак и летучие амины - метиламин, диметиламин, этиламин, диэтиламин, пропиламин, изопропил13

Биогенные амины идентифицируют

амин, бутиламин, изобутиламин, пиперидин и другие, а нелетучие биогенные ц по флуоресценции в УФ-свете сравнени

49872

лизируемом объекте. Например, по 20 мг гистамина, фенетиламина, путре- сцина, кадаверина растворяют в 100мл 0,02 н. соляной кислоты. Аликвотные коли 1:ества стандартного раствора, например 20 и 100 мкл, превращают в те же: производные, что и в опытной пробе.

10 получения производных по 5- 10 мкл бензольных растворов опытной и стандартных проб наносят на одну пластинку и хроматографируют.

Биогенные амины идентифицируют

ц по флуоресценции в УФ-свете сравнени

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения микроколичеств нежелательных токсикд,нтов в пищевых продуктах и биологических объектах. Цель изобретения заключается в повышении достоверности определения. Способ заключается в подщелачи- вании до рН от 9 до 14 растворов, содержащих биогенные амины и летучие амины. При Подщелачивании удаляются аммиак и летучие амины - мелиламин, диметиламин, этиламин, диэтиламин, пропиламин, изопропиламин, бутил- амин, изобутиламин, пиперидин и др., а нелетучие биогенные амины остаются в остатке. 1 табл. С/)

амины остаются в остатке. При дальнейшей обработке реагентами для получения производных, например дансил- хлоридом, в пробе образуются только производные анализируемых биогенных аминов, которые легко разделяются и определяются с помощью ТСХ. В зтом случае помехи, создаваемые наличием в пробе производных аммиака и летучих аминов, отсутствуют, что облегчает расшифровку хроматограмм и существенно увеличивает достоверность определения по сравнению с известными методами.

Способ осуществляется следующим образом.

Пробу пищевого продукта гомогенизируют с водным раствором кислоты, например 0,02 н. соляной, или со смесью водного раствора кислоты и ацетона, центрифугируют или фильтруют и аликвотную часть упаривают досуха. Остаток тщательно перемеишвают с 50%-ным метанолом или этанолом. С помощью 0,01 н. спиртового раствора щелочи устанавливают рН пробы 9-14, преимущественно 9-11, и упаривают при 90-100 С досуха. При этом из зкстракта удаляются аммиак и летучие амины. Содержащиеся в остатке нелетучие бцогенные амины превращают в соответствующие производные, например дансиламиды. Для этого к остатку приливают дистиллированную воду и ацетоновый раствор дансилхлорида, выдерживают 14-16 ч при комнатной температуре или 1,5-2 ч при 50°С, затем добавляют воду и бензол, энергично встряхивают и отбирают органический слой. Параллельно готовят такие же производные из смеси химически чистых биогенных аминов, набор которых обусловлеи предполагаемой номенклатурой биогенных аминов в анаем пятен в опытной и стандартных пробах. При этом визуально можно оценить содержание биогенных аминов. Для количественного определения соответствузощие зоны элюируют одинаковым количеством бензола, центрифугируют или фильтруют и измеряют на флюори- метре интенсивность флуоресценции, используя в качестве пробы сравнения

стандартную пробу, наиболее близкую к опытной по содержанию анализируемых веществ.

Расчет концентрации (мг/кг или мг/л) биогенных аминов производят

по фэрмуле

C Klfi-ii-E, le- V- М

5

lo.Ic

0

5

0

5

где К - коэффициент,учитывающий взятую для анализа аликвоту; интенсивности флуоресценции элюатов опытной и стандартной проб, отн.ед.; V - объем нанесенного на хрома- тограмму злюата опытной пробы, мкл;

V - объем нанесенного на хрома- тограмму элюата стандартной пробы, мкл;

Р - количество определяемого амина в стандартной пробе, выбранной для сравнения, мг; М - масса образца пищевого продукта (4г) или объем (л). Пример 1. 10мл модельного экстракта, представляющего собой раствор, содержащий 20 мг/л аммиака, по 10 мг/л метиламина, диметиламина, диэтиламина, пропиламина, изопропил- ами(а, бутиламина и изобутиламина, а также по 0,5 мг/л путресцина, кадаве- ринг1, фенетиламина в 0,02 н. НС1, упаривают досуха. Осадок растворяют в 1 мл 50%-ного метанола, добавляют

0,01 н. раствор КОН в 50%-ном метаноле до рН 9 и упаривают при 100 С досуха. Остаток смешивают с 0,5 мл дистиллированной воды, добавляют 1,5 мл ацетонового раствора дансил- хлорида (3 мг/мл). доводят рН до 10 и выдерживают 16 ч при комнатной температуре. Затем в пробу вводят 2 мл воды и 1 мл бензола, тщательно перемешивают и отбирают бензольный слой. Аналогично дансилируют 20 и 100 мкл стандартной смеси, представляющие собой растворы (по 200 мкг/мл) нелетучих биогенных аминов (фенетиламина, 15 на. Пйтна с соответствующими R в

путресцина, кадаверина) в 0,01 н.НС1.

По 5 мкл опытной и обеих стандартных проб наносят на пластинку силу- фола и хроматографируют в системе бензол - триэтиламин (5:1). При рассмотрении в УФ-свете (360 нм) полученной хроматограммы в опытной пробе обнаружены только имеющиеся в стандартной смеси дансилпроизводные биогенных аминов - путресцин, кадаверин и фенетиламин (соответственно 0,4А, 0,56 и 0,63).

Пятна дансилпроизводных летучих аминов и аммиака в опытной пробе отсутствуют.

Пятна с одинаковыми R в опытной и стандартной пробах элюируют по 1 мл бензола, фильтруют и измеряют интенсивность флуоресценции при 360/490 нм.

Расчет, проведенный по формуле, показал, что в модельном экстракте содержится, мг/л: путресцин 0,48; кадаверин 0,49; фенетиламин 0,46.

П р и м е р 2. 0,01 кг (10 г) измельченного швейцарского сыра гомогенизируют с 60 мл смеси 0,02 н.НС и ацетона (3:1) и центрифугируют. Жцдкую фазу отделяют, отбирают 6 мл и упаривают досуха. Сухой остаток тщательно перемешивают с 0,5 мл 50%-ного метанола, добавляют 0,01 н. раствор КОН в 50%-ном метаноле до рН 10 и упаривают при 90 С досуха. К остатку добавляют 0,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл ацетонового раствора дансилхлорида концентрации 3 мг/мл, доводят рН до 9 и вьщержи- вают 2 ч при 50 С. Затем пробу охлаждают и вводят 2 мл дистиллированной

опытной и наиболее близкой по инте сивности стандартной пробах элюиру 1 мл бензола и измеряют флуоресцен (360, 490 нм) на спектрофлуориметр

20 Расчет, проведенный по формуле показал, что в швейцарском сыре со держатся, мк/кг: гистамин 10,7; пу ресцин 17,6; кадаверин 11,2.

Примерз. Юг (0,01 кг)

25 трески свежемороженной гомогенизиру с 50 мл 0,02 н. НС1 и фильтруют. О бирают 5 мл фильтрата и упаривают досуха. Сухой остаток тщательно пе мешивают с 1 мл 50%-ного этанола,

30 подщелачивают 0,01 н. КОН до рН 11 и упаривают при 100 С досуха. К ос татку добавляют 0,5 мл дистиллиров ной воды и 1,5 мл ацетонового раст ра дансилхлорида концентрации 4 мг

2 мл, доводят рН до 9,5 и оставляют ночь (16 ч) при комнатной температ ре. Затем к пробе добавляют 2 мл ди стиллированной воды и 1 мл бензола энергично встряхивают и отбирают ор

4Q ганический слой. Параллельно в две пробирки, содержащие по 0,5 мл дистиллированной воды, вводят 30 и 150 мкл стандартного раствора химически чистых гистамина, путресцина

g кадаверина, спермина и спермидина в 0,02 н. НС1 (по 200 мкг/мл каждог и дансилируют аналогично опытной пробе и хроматографируют в системе хлороформ - триэтиламин - бензол 15:3:10.

50

Рассматривают пластинку в УФ-све те (360 нм). В опытной пробе наблюд ются пятна с R, равными R пятен

Рассматривают пластинку в УФ-свете (360 нм). В опытной пробе наблюда ются пятна с R, равными R пятен

воды и 1 мл бензола, тщательно пере-gg гистамина, путресцина, кадаверина

мешивают и отбирают органическийи спермина. Пятна с одинаковыми R

слой. Параллельно в две пробирки,в опытной пробе и наиболее бизком

содержащие по 0,5 м.п дистиллирован-по интенсивности стандарте элюируют

ной воды, вводят 20 и 100 мкл стан-0,5 мп бензола и измеряют интенсив

дартного раствора гистамина, фенетил- амина, путресцина и кадаварина в 0,02 н. НС1 (по 200 мкг/мл каждого) и дансилируют аналогично опытной пробе. На хроматографическую пластинку с силикагелем КСК наносят по 5 мкл обоих стандартов и 10 мкл опытной пробы и проявляют в системе хлороформ - триэтиламин - бензол 15:3:10.

Визуально в УФ-свете (360 нм) рассматривают пластинку. В опытной пробе наблюдаются пятна, имеющие R,, равные R гистамина, путресцина и кадавериопытной и наиболее близкой по интенсивности стандартной пробах элюируют 1 мл бензола и измеряют флуоресценцию (360, 490 нм) на спектрофлуориметре.

Расчет, проведенный по формуле показал, что в швейцарском сыре содержатся, мк/кг: гистамин 10,7; путресцин 17,6; кадаверин 11,2.

Примерз. Юг (0,01 кг)

трески свежемороженной гомогенизируют с 50 мл 0,02 н. НС1 и фильтруют. Отбирают 5 мл фильтрата и упаривают досуха. Сухой остаток тщательно перемешивают с 1 мл 50%-ного этанола,

подщелачивают 0,01 н. КОН до рН 11 и упаривают при 100 С досуха. К остатку добавляют 0,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл ацетонового раствора дансилхлорида концентрации 4 мг/

мл, доводят рН до 9,5 и оставляют на ночь (16 ч) при комнатной температуре. Затем к пробе добавляют 2 мл дистиллированной воды и 1 мл бензола, энергично встряхивают и отбирают органический слой. Параллельно в две пробирки, содержащие по 0,5 мл дистиллированной воды, вводят 30 и 150 мкл стандартного раствора химически чистых гистамина, путресцина,

кадаверина, спермина и спермидина в 0,02 н. НС1 (по 200 мкг/мл каждого) и дансилируют аналогично опытной пробе и хроматографируют в системе хлороформ - триэтиламин - бензол 15:3:10.

Рассматривают пластинку в УФ-свете (360 нм). В опытной пробе наблюдаются пятна с R, равными R пятен

гистамина, путресцина, кадаверина

ность флуоресценции (360/490 нм) в опыте относительного стандарта.

Расчет по формуле показал, что в образце трески свежемороженной, содержатся, мг/кг: гистамин 7,4; путресцин 12,3; кадаверин 18,8; спемин 2,7.

Влияние рН на полноту удаления летучих аминов при упаривании растворов, содержащих различные амины концентрации 100 мг/мл, отражено в таблице.

Из приведенных в таблице данных видно, что подщелачивание раствора до рН вьше 8 обеспечивает полное удаление летучих аминов. Введение избытка щелочи нецелесообразно, поэтому предпочтительнее доведение рН до 9-11.

Надежная идентификация и определение нелетучих биогенных аминов достигаются по предлагаемому способу при их содержании 10-30 нг в пятне. Спо364987

соб вых

6

10

15

20

25

30

35

проверен на различных видах пищепродуктов. Предлагаемый способ идентификации и определения нелетучих биогенных аминов устраняет мешающее влияние на определение биогенных аминов аммиака и летучих аминов, содержащихся в экс- трактах из пищевых продуктов, существенно облегчает расшифровку хромато- грамм и идентификацию биогенных аминов, повьпиает достоверность определения за счет уменьшения вероятности получения ложных результатов.

Вследствие своей высокой чувствительности, простоты, быстроты и удобства выполнения способ может применяться как в научно-исследовательских учреждениях, так и в лабораториях гигиенического и биохимического профиля, например санэпидстанциях, для анализа биогенных аминов в пищевых продуктах и биологических объектах.

Формула изобретения

Способ определения нелетучих био- . генных аминов в пищевых продуктах, предусматривающий экстракцию их из образца, удаление растворителя, хро- матографическое разделение и количественное определение их, отличающийся тем, что,с целью повышения достоверности определения, в полученном экстракте осуществляют отделение летучих аминов путем доведения рН экстракта до 9 - 14.