Способ хроматографического определения летучих аминов и нитрозаминов Советский патент 1986 года по МПК G01N30/94 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для анализа микроколичеств летучих аминов и / -нитрозаминов в пищевых продуктах и других объектах окружающей среды.

Определению Г/ -нитрозаминов и аминов в воде, воздухе, пищевых продуктах и др. уделяется большое внимание так как ( -нитрозамиНы обладают выраженным канцерогенным действием, а амины являются их предшественниками и способны нитрозироваться в объектах и в организме человека и животных.

При хранении пищевик продуктов происходит существенное повышение концентрации нектор ых аминов, что может служить признаком их порчи.

Цель изобретения - упрощение идентификации и повьш1ение достоверности определения.

На чертеже представлена полученная хроматограмма.

Способ осуществляется следующим образом.

Пробу пищевого продукта или объекта окружающей среды (например, сточные воды) гомогенизируют с раствором хлорида и карбоната натрия с целью улучшения условий выделения и отгоняют амины в 0,1 н. соляную кислоту В случае извлечения )У-нитрозаминов образец гомйгенизируют с сульфатом натрия, а также сульфаниловой и уксусной кислотами для предотвращения образования нитрозаминов в процессе перегонки. В дистилляте растворяют едкий натр и карбонат натрия для связывания кислых примесей и экстрагируют нитрозамины эфиром.

Дистиллят, содержащий амины, упаривают досуха, растворяют в 2 мл 0,1 н. соляной кислоты и делят на две или более равных частей, например три. Две из них подщелачивают, например, карбонатом нат)ия до рН 8-14 (преимущественно до рН 9-11) и все части упариваются досуха. При этом из подщелоченных частей амины улетают. К этим частям добавляют различные количества стандартов. Стандарты получаю.т из химически чистых аминов (как в случае анализа самих аминов, так и при анализе tiнитрозаминов), набор которых обуслов-55 растворителем, например бензолом,

лен предполагаемой номенклатуройи измеряют интенсивность флуоресаминов или нитрозаминов в анализируе-ценции элюатов на флуориметре, исмом объекте. Например, по 20,0 мг ди-пользуя в качестве пробы сравнения

5

0

метил амин а, аллилами на, ди этил ами на ди-н-пропиламина и ди-н-бутиламина растворяют в 100 МП разбавленной соляной кислоты (0,1 мг/мл). Затем 1,0 мл этого раствора смешивают с 9,0 МП той же кислоты. Полученный таким образом раствор содержит по 20 мкг/мл (0,2 мкг/мкл) каждого амина.

Все пробы растворяют в одинаковом объеме органического растворителя, например 100 мкл бензола, и хрома- тогра ируют в системе растворителей, например, н-бутаиол - уксусная кисло- таг-вода. Пятна проявляют, например, парами иода и путем сравнения окрасок пятен опытной и стандартной проб идентифицируют и оценивают содержание аминов.

В случае определения нитрозаминов их переводят в соответствующие вторичные амины; для этого экстракт упаривают до 0,5 мл и обрабатывают раствором бромистозодородной кисло- 5 ты в уксусной Кислоте (реакция де- нитрозирования). Далее поступают как при определении аминов.

Для количественрого определения анализируемые соединения переводят 0 в легко дeтeктиpye Iыe п роизводные, окрашенные, флуоресцирующие или поглощающие УФ-излучение. Для этого все пробы обрабатывают раствором, например, 1-диметиламинонафталин-5- сульфохлорида или 7-хлор-4-нитробен- зо-2-oKca-l,3-диазола. Полученные три раствора экстрагируют органическим растворителем, например бензолом, и экстракты наносят на хрома- тографическую пластинку. При этом один из них является опытной пробой а два других - стандартными пробами, содержащими различные количества стандартных соединений. Про.бы хрома- тографируют в системе, например, гексан-хлороформ-эфир 5:5:1, пластинку подсушивают на воздухе и идентифицируют в УФ-свете анализируемые соединения сравнением пятен в опытной пробе с пятнами стандартных проб. При этом можно оценить содержание аминов в объекте визуально, сравнивая интенсивность флуоресценции пя- .тен опытной и стандартных проб. Затем пятна элюируют органическим

5

4С

45

50

3

стандартную пробу, наиболее близкую к опытной по содержанию анализируемых веществ.

Расчет концентрации аминов или нитрозаминов в объекте проводят по, формуле

f, ,- Нд- K V , / / С N ----- (кг/л или мкг/кг) . tit М

где /V - число проб, на которые

делят экстракт;

rluj Ht - интенсивность флуоресценции элюатов опытной и стандартной проб (отнсит .единицы). V - объем добавленного раствора стандартов, мкл; |М - масса, кг. или объем, л, пробы, взятой для анализа. Пример 1. К 200 мл сточной воды добавляют 70 г NaCl и 10 г и отгоняют 50 мл в приемник, в который предварительно заливают 5 МП 0,1 Н.НС1. Дистиллят упаривают до 2 мл и делят на две равные части Одну подщелачивают 5%-ным раствором NajCOj в воде до рН 10. и обе части упаривают досуха. В подщелоченную проёу добавляют 5 мкл стандартного раствора, содержащего по 20 мкг/мл диметиламина, аллиламина, диэтнлами- на, ди-н-пропиламина и ди-н-бутил- амина, К обеим частям добавляют по 1,5 мл ацетонового раствора дансил- хлорида (1 мг/мл), доводят рН до 8,5 и выдерживают 3 ч при 60°С, Затем добавляют по 1 мл воды и 0,5 мл бензола, тщательно переиещивают и отбирают бензольные слои-. По 50 мкл каждой пробы хроматографируют на од- ной пластинке сульфола в системе гексан-хлороформ-эфир 5:5:1 и рассмаривают в УФ-свете с у 365 им. Наличие фпуоресцирукяцих пятен с рав-- ными R в опытной и стандартной про бах свидетельствуют о наличии соответствующего амина. Полученная хрома изображена на чертеже. Для сравнения там же представлена хроматограмма тгансилированного раст вора чистых стандартов. Обозначения на чертеже: Д- опытная проба, 6 - стандартная проба, с - раствор cYaHдартов; 1,2,3,4 и 5 - дансильные производные аллиламина, диметилами- на, дизтиламина, ди-н-пропиламйна и ди-н-бутиламина соответственно. Пунктиром выделены зоны сравнения.

j

ю

5 0 5 5 5

0

1874

Хроматограммы Л , В и С показывают, что легче идентифицировать амины при сравнении А.и б , нежели Д и- , так как из-за наличия примесей, R/ веществ в А изменяются по отношению к Rf чистых стандартов в С , кроме того формы пятен в А и б идентичны, чего нельзя сказать о А и С . При элюировании проб зоны сравнения в Л и В одинаковы, в Л и С очевидны различия. В пробе С стандарт элюируется с чистого силикагеля, в пробах /, и 6 элюирование проводится с одинакового загрязненного фона. Все это делает идентификацию и определение более достоверньм при применении рекомендуемой стандартной пробы.

Пятна с одинаковыми R в опытной и стандартной пробах элюируют по 1 мл бензола, центрифугируют и измеряют интенсивность флуоресценции при 360/Л90 нм.

Расчет, проведенный по формуле, . показал наличие аллиламина, диметнл- амина, диэтиламина, ди-н-пропиламина и ди-н-бутиламина в концентрациях 6,0 мкг/л, 66 мкг/л, 33 мкг/л, 4,8 мкг/л и 3,9 мкг/л соответственно.

Пример 2.К 200 мл сточной воды добавляют 70 г NaCl и 10 г NaiCOi

и отгоняют 50 мл в приемник, в который предварительно заливают 5 мл 0,1 н. НС1. Дистиллят упаривают до 2 мл, делят на две равные части. Одну подщелачивают 5%-ным раствором Na СОз до рН 11 и обе части упари- вают досуха. К подщелоченной части пробы добавляют 100 мкл раствора , стандартов (как в примере I), а к другой части - 100 мкл разбавленной (0,1 мг/мл) НС1, перемешивают и добавляют по 400 мкл смеси н-бутанол - уксусная кислота - вода 4:1:5 (по объекту). По 100 мкл каждой пробы хроматографируют на одной пластинке с силикагелем в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода 4:1:5 (по объему). Пластинку подсушивают на воздухе, выдерживают в парах иода 1 мин и визуально, путем сравнения окрасок в опытной и стандартной пробе идентифицируют и оценивают со- держание аминов. В анализируемой воде обнаружены диметиламин - около 100 мкг/л и следы диэтиламина.

Пример 3. 100 г колбасы отдельной гомогенизируют с раствором 80 г Na2S04, 1 г сульфаниловой кис512591

лоты и 10 мл уксусной кислоты в 200 мл , добавляют 5 мл 4 М HjSO и отгоняют нитрозамины с водяным йаром. Собирают ШО мл дистглля- та, растворяют в нем 3 г NaOH и,

20 г Na2COjи дважды экстрагируют 60 мл диэтилового эфира. Объединенный экстракт сушат прокаленным Na2S04 и упаривают при 30°С до 0,5 мл; испаритель промывают 1 мл уксусной ю кислоты и добавляют к остатку. Туда же приливают 0,5 мл 3%-ной НВг в ледяной.уксусной кислоте и получен- . ную смесь делят на три равные части, которые нагревают при в таче- j ние 5 мин. Затем две части подщелачивают 5%-ным раствором до рН 9 и все части упаривают досуха. К подщелоченным частям добавляют: в одну - 2,. а в другую - 4 мкл стан- 20 дартного. раствора (пример 1). Кислую пробу подщелачивают до рН стандартных проб, добавляя раствор NagСО}. Во все пробы добавляют по 0,5 мл раствора НВД-хлорида (7- 25 хлор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол) в изопропаноле (0,2 мг/мл) и выдерживают при в течение 1 ч. На одну пластинку силуфола наносят по 20 мкл каждой пробы и хроматографнруют в систему хлороформ-бензол-этилацетат- уксусная кислота 18:10:3:0,5. Затем пластинку подсушивают и сравнением окрасок пятен в опытной и стандартных пробах в видимом свете и интенсивности флуоресценции в УФ-свете л Л 365 нм пятен с соответствующими значениями R| идентифицируют и оценивают содержание Л -нитрозаминов в пробе. Для количественного определе- ния пятна с одинаковыми значениями R снимают с пластинки, элюируют 1 мл бензола, центрифугируют и измеряют интенсивность флуоресценции 470/525. нм в сравнении со стандартом, наиболее близким по содержанию анализируемых веществ к опытной пробе. Расчет показал наличие нитрозодиметил- амина и нитрозодиэтиламина в концентрациях 4,9 и 2,1 мкг/кг соответственно.

35

45

50

Вли1чние рН на полноту удаления летучих аминов при упаривании растворов, содержащих различные амины, на- например диэтиламин (ДЭА, T«,a 55, и ди-н-бутиламин ( ) при исходных концентрациях 0,2 мг/мл отражено в таблице.

87

ДЭА О 99,3 100 100 100 ДВА О 97,6 100 100 100

Из приведенных материалов видно, что подщелачивание раствора до рН Bbmie 8 обеспечивает полное удаление летучих аминов. Введение значитель- ного избытка щелочи нерационально, поэтому целесообразно подщелачивать раствор до рН 9-11.

Надежная идентификация и определение по предлагаемому способу достигается при содержании 2-10 нг в

пятне (по флуоресцирующим производным) .

Способ проверен на различных видах вода и пищевых продуктов - мясных, рыбных и молочных.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно облегчить расшифровку хроматограмм и облегчает идентификацию определяемых аминов и нитрозаминов.

Вследствие своей простоты, быстроты и удобства выполнения способ может найти применение как в научно- исследовательских учреждениях, так и в лабораториях гигиенического (санэпидстанции и др.) экологического и производственного для анализа летучих аминов и ft -нитрозаминов в пищевых продуктах, кормах, воде, воздухе, почве, продуктах химической и резиновой промьшленности и др.,

Надежность и простота выполнения, позволяет рекомендовать этот метод для применения при анализе с помощью тех, когда наличие примесных соединений затрудняет сравнение хроматог- рамн опытной пробы со стандартами.

Формула изобретения

Способ хроматографического определения летучих аминов и нитрозаминов путем экстракции их из анализируемого образца, отгонки растворителя, .растворения остатка, нанесения

полученного анализируемого и стандартных растворов на хроматографичес- кую пластинку, разделения их в системе растворителей с последующей идентификацией и количественным анализом, отличающийся тем, что, с целью упрощения идентификации и повышения достоверности определения, остаток после отгонки растворителя обрабатывают 0,1 н. соляной

Т

с

f с

dD

С (/

Редактор В.Данко

Составитель В.Шкилькова Техред А.Кравчук

Заказ 5116/43Тираж 778 .Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

.Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул. Проектная,4 .

кислотой, делят на две или несколько аликвотных частей, обрабатывают их, кроме одной, щелочью до рН 8-14, упаривают досуха и растворяют с последующим использованием раствора необработанной части в качестве анализируемого, а растворов щелочных частей - в качестве стандартных после добавления к ним стандартных соединений.

.i

5.Я/-Л75

.Rf-MS .

J..Se

г.itfO.49

.39

Корректор Т.Колб