Способ дифференциальной диагностики возбудителей газовой гангрены Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/04 G01N30/88 

Изобретение относится к хроматогра- фическим методам исследования, в частности к области применения высокоэффективной жидкостной хроматографии в бактериологии.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Это достигается тем, что в способе, включающем выращивание клостридии на мясном бульоне, получение производных аминов и их хромэтографическое определение, в пробу культуральной жидкости вводят внутренний стандарт, осаждают белки хлорной кислотой, отделяют осадок белков центрифугированием, центрифугат обрэбатывают раствором дансилхлорида в ацетоне, продукты реакции разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией, при этом вид клостридии определяют по соотношению содержания аминов в культуральной жидкости и среде культивирования.

Кл. перфрингенс определяют при наличии в пробе/ - фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина в следующих соотношениях:

-40-100:й-2-1ЈэП кг -4-14.

NYKм2) /М3к NV

где NI, N2, N3 и N4 - отношение площадей хроматографических пиков / -фенилэтила- мина, путресцина, кадаверина и гистамина

00

ю

Јь

4

О

площади пика пнутреннего стандарта в ультуральной жидкости, соответственно:

Ми, N2, Мзк и Mi - отношение площаей хроматографических пиков / -фенилэ- иламина, путресцина, кадаверина и истамина к площади пика внутреннего тандарта в среде Вейнберга, соответствено.

Кл.эдематиенс определяют при наличии пробе / -фенилэтиламина, путресцина, адаверина и гистамина в следующих соотошениях;

N4-4n-mn-- -2 I

I UU, ТПГ I iTTP I miI

N«NZK, Nj

Кл.гистолитикум определяют при налиии в пробе р -фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина в следующих соотношениях:

N,1 0N, N, N.ZKN.«Nuk

Кл.септикум определяют при наличии в пробе /3 -фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамипэ о следующих соотношениях:

N/ л. N2 О /irvN3 -1 fi.4 , тгг -1 тг 40 тг 1.

N«

Введение в пробу внутреннего стандарта (1,6-диаминогексан) позволяет выражать результаты через отношение площади пика конкретного амина к площади пика внутреннего стандарта и т.о. получать относительные количественные показатели содержания аминов в культуральных жидкостях клостридий.

Возможность учитывать различия между видами не только качественные (наличие или отсутствие амина), но и количественные (содержание амина по отношению к внутреннему стандарту) повышает специфичность дифференциации видов.

Использование внутреннего стандарта, кроме того, позволяет улучшить другие характеристики метода;

повышается точность определения за счет исключения ошибок, связанных с про- боподготовкой, вводом пробы в хроматограф, нестабильностью рабочих условий хроматографии;

упрощается анализ и обработка результатов за счет сокращения числа рассматри- ваемых информативных компонентов до четырех вместо 18-ти в прототипе.

Существенным отличием предлагаемого способа является применение высокоэффективной жидкостной хромэто рафии (ВЭЖХ) для анализа аминов в культуральных жидкостях в целях дифференциальной диагностики видов возбудителей газовой гангрены

Определение аминов как специфических метаболитов клостридий проводилось ранее методами газовой хроматографии (ГХ) или методами ГХ в сочетании с масс-спект- рометрией. Цель работ состояла в выявлении спектра аминов, продуцируемых разными видами в среду культивирования. Работы велись на качественном уровне.

Использование метода ВЭЖХ для ана- лиза аминов в культуральных жидкостях позволяет в совокупности с остальными признаками повысить воспроизводимость и специфичность определения клостридий.

На фиг.1 показана хроматограмма дан- 5 силпроизводных аминов среды Вейнберга, где 1 - ft -фенилэтиламин, 2 - путресцин, 3 - кадаверин, 4 - гистамин, 5 - внутренний стандарт; на фиг.2 - хроматограмма дансил- производных аминов культуральной жидко- 0 сти Кл.перфрингенс; на фиг.З - хроматограмма дансилпроизводных аминов культуральной жидкости Кл.эдематиенс; на фиг.4 - хроматограмма дансилпроизводных аминов культуральной 5 жидкости Кл.гистолитикум; на фиг.5 - хроматограмма дансилпроизводных аминов культуральной жидкости Кл.септикум.

П р и м е р 1. Способ идентификации Кл.перфрингенс осуществляется следую- 0 щим образом.

Культуру инкубируют в среде Вейнберга. содержащей 1% глюкозы, под вазелиновым маслом при 37°С в течение 24 часов,

Культуральную жидкость центрифугиру- 5 ют 15 мин при 5000 об/мин.

К 1 мл центрифугата добавляют внутренний стандарт (1,6-диаминогексан) в количестве 5-10 моль.

Осаждают белки 1 Н хлорной кислотой, 0 озятой в отношении 1:2 к обьему пробы.

Осадок белков отделяют центрифугированием 15 мин при 8000 об/мин. Центрифу- гат нейтрализуют насыщенным раствором углекислого калия до величины рН 7,0. 5 Осадок перхлоратов калия отделяют центрифугированием 10 мин при 8000 об/мин.

Получение дансилпроизводных аминов.

К 0,5 мл центрифугата в темной склянке 0 добавляют 30 мг сухого карбоната калия и 1 мл дансилхлорида в ацетоне (5 мг/мл). Сосуд завинчивают крышкой и термостатиру- ют 30 мин при температуре 60°С.

Через 30 минут к реакционной смеси 5 добавляют 10 мг пролина для связывания избытка реагента и термостатируют еще 10 мин при температуре 60°С Отбирают 20 мкл и более реакционной смеси и вподчт в хроматограф. Хромэтографируют н, обрящен- нофазной колонке (С к1) э чоп| , «ч -ным

(по объему) раствором ацетонитрила о воде со скоростью 1 мл/мин.

Выход аминов с колонки регистрируют фотометрическим детектором на длине вол- ны 254 нм.

На хроматограммах (фиг. 1-5) идентифицируют пики/9 -фенилэтиламина 1, путрес- цина 2, кадаверина 3 и гистамина 4 по временем удерживания, полученным для стандартных веществ и рассчитывают отно- шения площади пика каждого из аминов к площади пика внутреннего стандарта, которые обозначают как NI. N2. N3 и N4, соответственно.

Параллельно проводят анализ среды Вейнберга, результаты которого служат контролем. Для контроля характерно незначительное содержание всех четырех рассматриваемых аминов. Рассчитанные для контроля отношения площадей пиков / - фенилэтиламина. путресцина, кадаверина и гистамина к площади пика внутреннего стандарта, обозначают как NiK, №, №к и

N4.

Данные экспериментов приведены в таблице и на хроматограммах (фиг. 1-5). Кл.перфрингенс определяют при

N4

Nt

j±- 40-100 (ft -фенилэтиламин 1) и -j

4-14(гистамин 4), путресцин2и кадаверин 3 содержатся на уровне контроля (табл., фиг.1 и 2).

П р и м е р 2. Способ идентификации Кл.эдематиенс осуществляется следующим образом.

Рост культуры и анализ культуральной жидкости выполняют в соответствии с условиями, приведенными в примере 1.

На хроматограммах идентифицируют пики аминов и рассчитывают отношения площадей этих пиков к площади пика внутреннего стандарта. Результаты сравнивают с контролем (средой культивирования).

Кл.эдематиенс определяют при тг°

40-100 ( ft -фенилэтиламин 1), путресцин 2. кадаверин 3 и гистамин 4 содержатся на уровне контроля (табл., фиг.1 и 3).

П р и м е р 3. Способ идентификации Кл.гистолитикум осуществляется следую- щим образом.

Рост культуры и анализ культуральной жидкости выполняют в соответствии с уело- виями. приведенными в примере 1.

На хроматограмме идентифицируют пики аминов и рассчитывают отношения площадей этих пиков к площади пика внутреннего стандарта. Результаты сравнивают с контролем (средой культивирования).

N

Ри NM

Кл.гистолитикум определяют

60-300 (путресцин 2) и (кэдзпеNIK

рин 3), Р -фенилэтиламин 1 и гистамин 4 содержатся на уровне контроля (табл.,фиг.1 и 4).

П р и м е р 4. Способ идентификации Кл.септикум осуществляется следующим образом.

Рост культуры и анализ культуральной жидкости выполняют в соответствии с условиями, приведенными в примере 1.

На хроматограммах идентифицируют пики аминов и рассчитывают отношения площадей пиков. Результаты сравнивают с контролем.

Кл.ссптикум определяют при r1-f 2-40

If

(путресцин 2). кадаверин 3 находится на уровне контроля или превышает его, но не

более, чем в шесть раз -гг . ft -фениNi ;

лэтиламин 1 и гистамин 4 находятся на уровне контроля (таблица, фиг.1 и 5).,

В предлагаемом способе по сравнению с прототипом подготовка пробы культуральной жидкости состоит из простых операций осаждения белков хлорной кислотой и окрашивания аминов дансилхлоридом (5-NI.N- диметиламипонафталин-1, сульфохлорид). Отсутстиие стадии экстракции органическими растворителями нативных аминов исключает возможные потери вследствие высокой растворимости диаминов в воде. Дансиламнны устойчивы в течение нескольких дней и обладают способностью флуоресцировать и поглощать ультрафиолетовые лучи на длине волны 254 нм, что делает возможным применение как флюоресцентного, так и фотометрического детекторов для регистрации аминов при хроматографии. Чувствительность метода (предел детектирования по поглощению составляет п. 10 моля; по флюоресценции на порядок и более выше) позволяет анализировать реакционную смесь после данси- лирования непосредственно без предварительного концентрирования.

Упрощение операций, использование меньшего количест DO аминов для идентификации вида клостридий позволяет сократить время и повысить специфичность анализа. Объем вводимой в хроматограф анализируемой пробы может колебаться от 1 до 100 мкл в зависимости от концентрации аминов. Хроматография занимает 30 минут

Поскольку исход заболевания газовой гангреной во многом зависит от своевременности и целенаправленности СПРЦИФИческого лечения, жизненно важным является быстрое установление вида ведущего возбудителя.

Недостатком большинства бактериологических и биохимических методов дифференциации видов является недостаточная специфичность и необходимость использования тестовых биологических материалов, требующих высокой исходной чистоты, а также контроля и обновления их в процессе хранения, подопытных животных.

Предлагаемый метод обладает высокой специфичностью и достоверностью диффе- ренции видов; не требует для выполнения диагностики специфического биологического тестового материала (ферментов, сывороток, индикаторных сред, диагностикумов, экспериментальных животных); реактивы универсальны и допускают длительное хранение; методика подготовки пробы к анализу, а также сам анализ, просты и хорошо воспроизводимы, могут быть легко стандартизованы и унифицированы.

Внедрение предлагаемого метода о практику бактериологических лабораторий дополнительно к традиционным методам будет способствовать повышению достоверности дифференциальной диагностики и сокращению времени анализа (теста).

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

1. Способ дифференциальной диагностики возбудителей газовой гангрены, включающий выращивание клостридий на мясном бульоне, получение производных аминов из культуральной жидкости, разделение их хроматографическим методом и определение по их содержанию вида клостридий, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в пробы культуральной жидкости и контрольной питательной среды вводят внутренний стандарт, осаждают белки хлорной кислотой, образовавшийся осадок центрифугируют, центри- фугат обрабатывают раствором дансилхлорида в ацетоне, полученные производные аминов разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией и

определяют вид клостридий по соотношению содержания аминов в культуральной жидкости и контрольной питательной среде.

2. Способ по п. 1,отличающийся

тем. что в качестве внутреннего стандарта используют 1.6-диаминогексан.

3.Способ по п.1. о т л и ч.а ю щ и и с я тем, что Cloctrldlum perfrlngens определяют

0 при наличии в культуральной жидкости fl- фенилэтиламина,путресцина,кадаверина и гистамина в следующих соотношениях:

N,40-100; Ј- Ф 1;й- 4-14, N/кNZK NjK NM

5 где Ni, N2, N3 и N4 - отношение площадей хроматографических пиков / -фенилэтила- мина. путресцина, кадаверина и гистамина к площади пика внутреннего стандарта в среде культивирования соответственно.

NIK. N2. N3 и - отношение площадей хроматографических пиков /3-фенилэ- тиламина, путресцина, кадаверина и гистамина к площади пика внутреннего стандарта в контрольной питательной среде соответственно.

4.Способ по п.1,отличающийся тем, что Clostrlslum hlstolyticum определяют при наличии в пробе / -фенилэтиламина, путресцина,кадаверина и гистамина в следующих соотношениях:

0

5

0

N4 , N сп олп NJ

. тг 60-300:-гг NIK.NK

5-15:й- N//

1.

5. Способ по п.1,отличающийся

тем, что Clostrldlum oedematiens определяют при наличии в пробе /9 -фенилэтиламина, путресцина, кадаверина и гистамина в

следующих соотношениях:

Ј- 40-100; .N3 N. N/xN/к Ni( NM

б. Способ по п.1,отличающийся тем, что Clostridium septicum определяют при наличии в пробе / -фенилэтиламина, путресцина. кадаверина и гистамина при следующих соотношениях:

NjLv Nf 2-40- 3

N« нN3

1-6:й -1.

N

К

Использование: микробиология, применение высокоэффективной жидкостной хроматографии для диагностики анаэробных инфекций. Сущность изобретения: для дифференциальной диагностики возбудителей газовой гангрены клостридии выращивают на мясном бульоне, с целью получения производных аминоп п пробы культуральной жидкости и контрольной питательной среды вводят внутренний стандарт, белки осаждают хлорной кислотой, осадок центрифугируют, центрифугат обрабатывают раствором дансилхлорида в ацетоне и полученные производные аминов разделяют ВЭЖХ, а вид клостридии определяют по соотношению содержания производных аминов в культуральной жидкости и контрольной питательной срсдо, В качестве внутреннего стандарта используют 1,6-диаминогексан. 1 Clostrdiumi perfringcns, Clostrlclium hlstolytlum, Clostridium oedematlens, Clostrldlum septicum определяют при наличии в культуральной жидкости / -фенилэти- ламина, путресцина, кадаверина и шстамина в определенных соотношениях. 5 з.п. ф-лы, 5 ил,, 1 табл. сл с

Относительное содержание аминов в культуральных

жидкостях клостридий после 24-часового роста на

среде Вайнберга

Примечание: амины в контроле обозначены NIK, М2к,Мз«, N4

г- О

-г10

Фиг. I

Продолжение табл.

20 мин

нии Q2

нии 02 i

i.

01

О

9WfrZ8L

VJ

-Г

10

20 мин