Способ определения активности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных Советский патент 1991 года по МПК G01N33/573 

Изобретение относится к биохимии, а именно к энзимологии, и может быть использовано для определения активности орнитиндекарбоксилазы (ОДК) в тканях животных.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве источника фермента используют супернатант 33%-ного гомогената, полученный центрифугированием при 20 000 g в течение 20 мин. Инкубац-ию пробы, содержащей в 0,4 мл конечного объема 4 ммоль орнитина, 20 мкмоль пиридок- сальфосфата, 5 мкмоль дитиотреитола, 5 ммоль K-Na-фосфатного буфера и 9.5+0,7 мг

белка (источник фермента), при 37°С прекращают через 1 ч добавлением 0,1 мл 0,2 М HCI04 Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин. Данси- лирование проводят, добавляя к 0,1 мл супернатанта 0,3 мл раствора дансилхлори- да в ацетоне (4 мг/мл) и 6 мг Ма2СОзЮН20. Пробы инкубируют не менее 18 ч в темноте при комнатной температуре. Продукты реакции экстрагируют бензолом в объемном соотношении 1:(1,3-1,5). Органический слой выпаривают, сухой осадок растворяют в 20 мкл ацетона и наносят на пластины Силуфол UV-254. Одномерно восходящую хроматографию проводят двукратно в системе бен- зол-триэтиламин в соотношении (5,0-5,5): 1. Интенсивность флуоресценции дансилпуто

00

Оч

со VI

CJ

ресцина измеряют на микроскопе ПРОТВА- С при 488 нм. Длина волны возбуждения 365 нм.

За единицу активности ОДК принимают 1 катал. Удельную активность фермента вы- ражают в п каталах, отнесенных к 1 мг белка.

Пример Работу выполняют на самцах беспородных крыс и мышей линии СЗПА гепатомы 48 и Г-27. Исследуют также малиг- низирущую, регенерирующую и нормальную печень. Ткань гомогенизируют в 0,5 мМ фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 0.1 мМ дитиотреитол и 0,4 мл пиридоксальфос- фат. Дальнейшее определение активности ОДК проводят по предлагаемому способу Численные данные опытов подвергают статистической обработке. Различия между средними величинами (X) расценивают как статистически достоверные при значении р 0,05.

Апробацию данного метода осуществляют в исследованиях уровня активности ОДК в печени интактных животных и тканях с усиленной клеточной пролиферацией. Об- наружено статистически достоверное увеличение активности ОДК в регенерирующей и малигнизирующей печени а также в ткани гепатом Г-27 и 48.

Активность ОДК(п каталов на 1 мг белка) в гепатомах Г-27 и 48 и в ткани нормальной и регенерирующей печени интактных и получавших НДЭА животных приведена в табл.1.

Данные, приведенные в табл 2 и 3, показывают преимущества предлагаемого способа перед известным.

Активность ОДК (п каталов на 1 мг бел- ка) из печени интактных животных перевивных гепатом приведена в табл. 2

Из табл.2 видно, что активность ОДК в одном и том же объекте в 2-8 раз выше, когда определение проводят по предлагав-

MOMV способу Кроме того, точность анализа также выше в 2 4 раза

В табл 3 приведены данные сравнитель ной оценки достоверности результатов анализа активности ОДК известным и предлагаемым способами.

Из табл 3 видно что величина удельной активности ОДК из нормальной печени крыс, определенная предлагаемым способом, в 2 раза выше, чем определенная по известному способу Надежность точность и воспроизводимость результатов также вы ше в 2-6 раза.

Представленные численные данные доказывают положительный эффект способа, заключающийся в повышении его чувствительности определения в 23 раза, а также в повышении точности, воспроизводимости и надежности способа в 2-6 раз по сравнению с известным.

Формула изобретения

Способ определения активности орни тиндекарбоксилазы в тканях животных включающий гомогенизацию ткани центрифугирование получение супернатанта, инкубацию с субстратом, осаждение белка защелачивание среды добавление реагента, образование окрашенного комплекса с путресцином, экстрагирование комплекса органическими растворителями с последующей регистрацией окрашенного комплекса отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве реагента используют дансилхлорид инкубацию с которым проводят не менее 18 ч, экстрагирование производят бензолом, взятым в объемном соотношении к раствору окрашенного комплекса 1.(1,3 1,5), полученный осадок дансилпутресцина растворяют в ацетоне, проводят восходящую хроматографию в тонком слое силикагеля в системе растворителей бензол - триэтанола- мин (5,0-5,5). 1 и выявляют индивидуальную фракцию дансилпутресцина, количество которого определяют флуориметрически

Т а б л и ц а 1

Продолжение табл.1

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения активности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ заключается в том, что препарат ткани инкубируют с ор- нитином и пиридоксальфосфатом, осаждают белки, к супернатанту добавляют дансилхлорид и проводят с ним инкубацию не менее 18 ч. Затем окрашенный продукт экстрагируют бензолом, взятым при объемном соотношении к раствору окрашенного комплекса 1:(1,3-1,5). Полученный осадок дансилпутресцина растворяют в ацетоне, проводят восходящую хроматографию в тонком слое силикагеля в системе растворителей бензол:триэтаноламин (5.0-5,5): 1 и выявляют индивидуальную фракцию дансилпутресцина, количество которого определяют флюориметрически. Способ позволяет повысить точность определения орнитиндекарбоксилазы в 2-6 раз. со С

Примечание: х - выборочное среднее

Sx - стандартное отклонение среднего результата. Р - уровень доверительной вероятности.

Основные метрологические

характеристики

Выборочное среднее (х)

Стандартное отклонение

среднего результата (±)

Абсолютная вопроизводимость:

Среднее отклонение от среднего

Стандартное отклонение Относительная воспроизводимость, %

Относительное среднее отклонение (Ех ) Относительное стандартное отклонение

Таблица2

Табл ицаЗ

Способ определения

Известный

Предлагаемый

0.09

±0,01

0,18 ±0,003

0,02 0,03

0,007

0,003

22,22 33,33

3,89 5.0