Способ определения полиаминов Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

35

;о Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения полиамннов в тканях животных и человека. Известен способ определения поли аминов и их производных с помо1цью ферментативных реакций tl3 Известен также способ определения полиаминов с использованием флуорес цирующего реагента и последующей.хро матографией в тонком слое 23. Недостатком известного способа является использование нескольких сложных раство4 ителей, что значитель но удлиняет время проведения анализа Цель изобретения - ускорение способа. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения полиаминов путем гомогенизации биоло гичес«ой ткани, дансилирования гомог ната, экстрагирования дансилированны полиаминов с последующей тонкослойной хроматографией в системе растворителей хроматографию проводят в системе растворителей бензол-триэтиламин в соотношении (5:t)-(5,5:1). Способ осуществляют следующим обр зом. Для анализа используют 33%-ный свежеприготовленный гомогеиат печени (соотношение массы ц объема 1:2). Ткань- гомогенизируют в 0,05 мМ фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 0,1 ммоль/л дитиотреитола (Serva, ФРГ) и 0,4 ммоль/л пиридоксальфосфата (Reanal, Венгрия). Все манипуля ции с тканью проводят на холоде при . Экстрагирование полиаминов проводят равнь мобъемомО,2М НС1О4. Пробы центрифугируют при 5000 об/мин в тече ние 5 мин.К 0,1 мл супернатанта добавля ют 0,3 мл раствора дансилхлорида (Sch chardt, ФРГ) в ацетоне (4 мг/мл) и Ь мг Na COj-IO HjO. Пробы инкубируют 18-20 ч в темноте при комнатной температуре. Продукты реакции экстра гируют 0,5 мл бензола. Органический слой переносят в коническую центрифужную пробирку и оставляют выпариваться на ночь при комнатной темпера туре а темноте. Осадок растворяют в 20 мкл бензола и наносят на пластинки ручного и пррмышленного изготовления (Каvalier, Чехословакия). Суспензию готовят с двойным количеством воды из расчета 28 г сухого силикагеля марки ЛС 5/40 (Chemapol Чехословакия) на 1 см2 поверхности. Связывающим веществом является гипс (5-15%) Пластины высыхает за ночь при комнатной температуре. Активирование проводят при в течение 30 мин. На остывшую пластину наносят одновременно до .10 проб на расстоянии 2 см от нижнего и боковых краев. Готовые пластины Silufol UV-254 с подложкой из алки4иниевой фольги в качестве сорбента имеют широкопористый силикаг ль по Петри с люминесцентным индикатором. Связывающим веществом служит крахмал. Однрмерную хроматографию проводят двукра тно в системе бензол-тризтиламин в соотношении 5:1-5 5:1 в течение 45 мин. Дансилпроизводные аминокислот и гидролизованный реактив остаются на линии -старта. Избыток дансилхлорида не мешает идентификации пятен. Пятна дансилполиаминов обнаруживают по желто-зеленому свечению в ультрафиолетовом свете. Идентификацию пятен фракций полиаминов проводят с помощью свидетелей - препаратов солянокислых производных путресцина, спермидина и спермина (Sewa, ФРГ). Интенсивность флоуресценции измеряют прямьш сканированием пятен на автоматизированном микроскопе-анализаторе ПРОТВА-С. Для регистрации интенсивности излучаемого света используют интерференционный светофильтр №4-6 с длиной волны в максимуме пропускания ммк,шириной пропускания в середине максимума 10 ммк и коэффициентом пропускания 22%. Напряжение ФЭУ равно 700 В. Длину волны возбуждения 365 ммк получают с помощью фильтров УФС-6 (толщина 5 мм) и СЭС-24 (толщина 4 мм). В качестве источника света используют лампу ДРШ-250г-2. Концентрации полиаминов рассчитыают по калибровочным графикам и выажают в. нмоль/мг белка. Белок опрееляют; по Лоури. Пример 1. В качестве модели кани с повьш1енным митотическим инексом используют перевивные гепатоны -27 и 46, регенерирующую и мадигниирующую печень. Штамм гепатомы 46 ассируют на самцах мьш1ей линии ЗНА. Штамм гепатомы Г-27 пассируют , а крысах-самцах рандомбредногр разедения. Частичную гепатэктомию пронэводят по методу Хиггинса и Андерсона. Малигнизацию печени крыс вызывают нитрозодиэтиламином (НДЭА). НДЭА вводят внутрибрюшинно 1 раз в неделю в течение 2 мес. из расчета 100 мг на 1 кг веса животного. Всего каждому животному введено 154 мг канцерогена.

Животных забивают путем декапитации. Печень немедленно извлекают.

Далее определение полиаминов проводят согласно предлагаемому способу с использованием бензол-триэтиламина в соотношении 4,5:1.

При этом выявлено: X,.- 0; путресцин - 0,32; Х2 - 0; спермидин - 0,37 и спермин - 0,42, где Х и Х -фракции неиндентифицированных аминов.

Пример 2. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, но при соотношении бензол - триэтиламин 5:1.

При этом выявлено: Х - 0,22; путресцин - 0,30; Х - 0,37; сперМ1здин - 0,43; спермин - 0,54.

Пример 3. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, но при соотношении бенэол-триэтиламин 5,5:1.

При этом выявлено: Х - 0,23; путресцин - 0,31; 2 - 0,37; спермидин 0,44; спермин - 0,53.

Пример 4. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, но при соотношении бензол-триэтиламин 6:1.

При этом выявлено: Хи,- 0} путресцин - 0,32; X2 - 0; спермидин - 0,39; спермин - О,45.

Таким образом, оптимальным для хроматографического разделения указан ных полиаминов следует считать 5:15,5:1 интервалы соотношений компонен тов используемого растворителя, при лтом из фракций дансилпроизводных полиаминов удаляются загрязняющие их вещества XL, и Х, а время анализа сокращается в 4 раза по сравнению с известным способом.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИАМИНОВ путем гомогенизации биологической ткани, данснлирования гомогената, экстрагирования дансилированных полиаминов с последующей тонкослойной хроматографией в системе растворителей, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, хроматографию проводят в системе paci(- ворителей бенэол-триэтиламин в соотношении