Способ определения концентрации иммунного комплекса и устройство для его осуществления Советский патент 1988 года по МПК G01N21/41 

Изобретение относится к области иммунохимии,, в частности к области колориметрических способов и фотоэлетрических устройств для оценки ферментативной активности, предназначено для количественной оценки результатов различных вариантов иммунофер- ментного анализа (ИФА) при определении антигенов и антител к ним и может быть использовано в лабораториях научно-исследовательских и лечебно- профилактических учреждений различного профиля.

Целью изобретения является повышение чувствительности определения. и упрощение конструкции устройства.

На фиг.1 представлены спектральные характеристики субстрат-индикаторного раствора 5-аминосалициловой кислоты; на - устройство для реализации способа.

Устройство включает в себя стабилизированный генератор 1 прямоугольных импульсов, источник излучения - светодиод 2 зеленого свечения, излучающий в области спектра 550-570 нм, кювету 3 с исследуемой пробой, приемник излученкк фотодиод 4, усилитель 5j логарифмирующий аналого-цифровой преобразователь 6 и блок 7 цифровой индикации.

Способ осуществляется следующим образом,

Твердофз.зный носитель (шарик из - полимера) вносят в 200 мкл раствора специфических антител (антигена) и инкубируют 2 ч при 37°С или 16 ч при . От избытка несвязавшихся антител (антигена) носитель отмывают фос фатно-солевым буферным раствором (ФСБР)с добавлением 0,05% твина-20.

Носитель с Ф«4Обилизованнь ми антителами (антигеном) вносят в исследуемую пробу, содержащую искомьш антиген (антитело) После инкубации в течение 30 мин при твердофазный носитель отмьЕвают от несвязавшихся реагентов ФСВР 0,05% тЕин-20.

Носитель, на поверхности которого находится комплекс антитеЛо - антиген, вносят в 200 мкл раствора конъю гата (специфические иммуноглобулины, меченые ферментом - перексидазой). После 30 мин контакта при 57 0 носитель промьгоают ФСБР + твин-20 от несвязавшегося кошьюгата.

Носитель, содержащий на поверхности комплекс антитело - антигенмечено

687282

антитело, вносят в 500 мкл субстрат- индикаторного раствора (орто-фенш. .гн- диамин, 5-аминосалициловая кислота)., Через ЗО мин реакцию останавливают добавлением в пробу равного объема 1н.раствора серной кислоты или NaOH и субстрат -индикаторный раствор фото- метрируют при длине волны 550-570 нм.

10 О количественном содержании искомого антигена - антитела судят по фер- ментативной активности связавшегося фермента (разрушение ферментного субстрата, дающее окрашенный проIT дукт) по величине оптической плотности.

Устройство, реализующее способ, работает следующим образом.

Сигналы с выхода генератора I

20 поступают на светодиод, который излучает последовательность световых прямоугольных импульсов, проходящих через кювету с .субстрат-индикаторным раствором и падающих на поверхность

25 фотодиода. Амплитуду тока питания в импульсе можно увеличить в 5-8 раз по сравнению с допустиг-юй величиной постоянного тока питания светодиода. При достаточно большой скважности

30 (50-100) средняя мощностье потребляемая светодиодом в 6-20 раз меньше, чем при постоянном токе питания„ Одновременно удается значительно увеличить мощность излучения светодиода

3g в импульсеS так как она возрастает по показательному закону с згвеличе- нием тока питания.

В качестве фотоприемника может быть применен любой кремниевый фото

40 диод с малой площадью фоточувстви- тельной площадки (2-3 ),. Схема усилителя является сравнит ально простой и не требует компенсации, дрейфа нуля, так как усилитель работает Б

45 и 1пульсном режиме

Сигнал с выхода усилителя поступает на вход логарифмирующего -йналс го-цифрового преобразователя отношения, на другой вход которого лоступа50 ет сигнал, соответстзуйщий значе.нию нулевой концентрации. Для запуска преобразова-телл не требуетс.н спдци- альаой схемы., запускающие а пульсы .поступают с выхода генератора 1 пря-

55 МОугольных кмпулъсов.

С .выхода преобразователя на вход блока индикация поступает пос..г.тедоЕа- тельность ЕмпульсоЕ, чнсло которых соответствует значеншс определяемой

313687284

оптической плотности субстрат-индика- Анализ экспериментально обобщенных

спектральных характеристик субстратторного раствора.

В основе способа лежит применение метода ИФА, при котором специфичес- с кие антитела или антигены соединены с поверхностью твердой фазы путем адсорбции, ковалентно или другими методами. Соединение фермент-конъюги- |рованных антител и антигена проводит- 10 ся прямым или непрямым вариантом. О количестве определяемого вещества судят по количеству связанной метки (фермента), измеряя интенсивность окиндикаторных растворов показал, что их оптическая плотность D может быть аппрокс гмирована выражением

,Jf, (D,5p)) fO,2,{2.)

где , - оптическая плотность раствора на длине волны 450 нм (для 5-аминосали- циловой кислоты);

и -150

100

менение длины волны излучения . Для раствора 5-аминЬсалициловой

- текущее относительное из25

рашивания субстрат-индикаторного 15 раствора. При использовании конъюга- тов иммуноглобулинов с пероксидазой наиболее доступными, дешевыми и достаточно чувствительными субстратами являются 5-аминосалицш1Овая кислота 20 и орто-фенилендиамин.

При больших разйедениях раствора с увеличением длины волны имеются либо незначительйые уменьшения оптических плотностей (разведение 1:8), либо оптические плотности практически не меняются (рйзведение 1:16). При этом оптическая плотность исходного субстрат-индикаторного раствора резко уменьшается с увеличением дли- 30 ны волны.

С переходом в длинноволновую область спектра при малых концентрациях иммунологически активного вещества оптическая плотность раствора 35 практически не уменьшается, при этом имеет место сужение динамического диапазона измеряемых оптических плотностей, В связи с этим для повьнпения чувствительности колориметрического 40 метода при измерении малых концентраций целесообразен переход в длинноволновую область спектра с одновременным увеличением разрешающей

менение длины волны излучения . Для раствора 5-аминЬсалициловой

кислоты функции f,, fj и постоянный

коэффициент / имеют вид

f, f.

(3)

.YJ, , 5 I

2 - 1 - f,;

/i 0,7.

Для раствора 0-фенилендиамина оптическая плотность аппроксимируется выражением, аналогичным (2), но с друпвт значениями коэффициентов f,

fj. /1

Светопропускание

,-Л1 )

T,o- io- 5(f,f3.(5)

где Е .у - коэффициент экстинции при

450 нм.

3«1

Исследование функции -- показа3ч

ло, что величина длины волны Д„ р при которой достигается максимум чув ствительности, определяется формулой

макс

450-ИОО

Я

- 2,3 -D 450

А ь2:з5 г ff т.«м(6

4-SO 1

Из расчетов по формуле (6) следуспособности первичного преобразова- 45 Р« уменьшении концентраций

раствора от максимума до значения, соответствующего 0,5, макс уменьшается от 650 до 510 нм; для 0,1 D 0,5 чувствительность d незначительно уменьшается при переходе с длины волны Д 450 нм на длину волны , нм. Так, (,92 и Л«-5о 0 87 для , 0,4; или 1,60, ft/j, I,54 при 0,5, 0,15.

теля.

При переходе на длинноволновую область спектра (Д 550-570 нм) удается упростить устройство, реадасзую- щее способ, так как в качестве источ- ника излучения можно использовать светодиод.

Чувствительность способа определяется выражением 5Т ЭК

;где Т - Светопропускание раствора; К - концентрация.

о/ (I)

индикаторных растворов показал, что их оптическая плотность D может быть аппрокс гмирована выражением

,Jf, (D,5p)) fO,2,{2.)

где , - оптическая плотность раствора на длине волны 450 нм (для 5-аминосали- циловой кислоты);

и -150

100

менение длины волны излучения . Для раствора 5-аминЬсалициловой

кислоты функции f,, fj и постоянный

- текущее относительное изкоэффициент / имеют вид

f, f.

(3)

.YJ, , 5 I

2 - 1 - f,;

/i 0,7.

Для раствора 0-фенилендиамина оптическая плотность аппроксимируется выражением, аналогичным (2), но с друпвт значениями коэффициентов f,

fj. /1

Светопропускание

,-Л1 )

T,o- io- 5(f,f3.(5)

где Е .у - коэффициент экстинции при

450 нм.

3«1

Исследование функции -- показа3ч

ло, что величина длины волны Д„ р при которой достигается максимум чувствительности, определяется формулой

450-ИОО

Я

- 2,3 -D 450

А ь2:з5 г ff. т.«м(6)

4-SO 1

Из расчетов по формуле (6) следу45 Р« уменьшении концентраций

- 50

55

раствора от максимума до значения, соответствующего 0,5, макс уменьшается от 650 до 510 нм; для 0,1 D 0,5 чувствительность d незначительно уменьшается при переходе с длины волны Д 450 нм на длину волны , нм. Так, (,92 и Л«-5о 0 87 для , 0,4; или 1,60, ft/j, I,54 при 0,5, 0,15.

Для D 4.уо 0,1 чувствительноо,ть al не зависит от длины волны в диапаар- не 450 - 650 нм.

При больших концентрациях целесообразен переход в длинно-волновую

OS

О.Ц

0.2

Исходный pacmSop

Изобретение относится к иммунохимии, в частности к колориметрическим способам и фотоэлектрическим устройствам, для оценки ферментативной актршности. Целью изобретения.является повышение чувствительности иммуно- ферментного анализа, а-также повышение чувствительности первичного преобразователя, упрощение конструкции устройства и уменьшение объема исследуемой пробы. Для этого фотометрирование проводят при длине волны 550-570 нм, при этом в качестве источника излучения используется свето- диод, и в устройство введены логариф- мирующий аналого-цифровой преобразователь отношения двух сигналов и стабилизированный генератор прямоугольных импульсов, выход которого соединен со светодиодом и запускающим входом аналого-цифрового преобразователя, причем первый вход преобразователя соединен с источником опорного напряжения, соответствующего нулевой концентрации, второй вход - с выходом усилителя. В основе способа лежит применение метода иммуно- ферментного анализа, при котором специфические антитела и антигены соединены с поверхностью твердой фазы путем адсорбции. Соединение фермент- коньюгированных антител и антигена проводится прямым или непрямым вариантом. О количестве определенного вещества судят по количеству связанной метки (фермента), измеряя интенсивность окрашивания субстрат - индикаторного раствора. При использовании коньюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой наиболее доступными и . чувствительными субстратами являются 5-аминосалициловая кислота и орто- фенилендиамин. 2 с.п. ф-лы, 2 ил. i (Я со о 00 м to СХ)

Ш УЮ 5 го 540 Ибо SSO 600 ,ни

Фиг.г