Способ определения стадии смолтификации у молоди лососевых рыб Советский патент 1988 года по МПК A01K61/00 

оо

05

со со

05

Изобретение относится к ихтиологии, в частности к способам определения стади(1 смолтификации, и предназначено для использования в рыбохозяйственной практике при организации индустриального выращивания семги в морской воде и заводском воспроизводстве.

Целью изобретения является упрощение и )5ышение точности определения стадий омолтификации у молоди лососевых рыб.

Предлагаемый способ может быть использован: при отработке биотехнологии выращивания молоди семги в условиях, ускоряющих рост и развитие (например, при использовании подогрева воды); в исследовательских работах при изучении влияния различных факторов на смолтификацию (например, продолжительность фотопериода); при оценке сроков смолтификации и выпуска молоди на рыбоводных заводах при непосредственном участии в этих работах научного работника.

Способ основан на том, что у рыб осмотическая адаптация к морской воде связана с наиболее существенной чертой перестройки жаберного эпителия - изменением типов межклеточных контактов и вследствие этого увеличением проницаемости ткани для ионов.

Ведущую роль в ионной и осмотической регуляции у рыб играют структурные единицы жабр - хлоридные клетки, через которые происходит направленный транспорт ионов.

В зависимости от типа ионного обмена (пресноводного или морского) хлоридные клетки характеризуются определенным набором морфологических признаков.

На чертеже изображена схема организа- пин хлоридных клеток с признаками стадий смолтификации: А - стадия пестрятки; Б - стадия серебристой пестрятки; В - стадия смолта.

На чертеже обозначено: 1 - апикальная цитомембрана; 2 - плотный контакт; 3 - десмосома; 4 - щелевой контакт.

Стадии смолтификации характеризуются следующими признаками: стадия пестрятки (parr) - складчатость апикальной цито- мембраны выражена слабо, не регулярно (складчатость цитомембраны определяется наличием впячиваний и выростов на поверхности). Соседние хлоридные клетки соединены между собой плотными контактами, под хлоридными клетками находится слой малодифференцированных клеток (А , поз. 1).

Малодифференцированные клетки отличаются от хлоридных по своему расположению в основании жаберного эпителия и структурной организацией ЧЭни имеют овальную форму, светлую цитоплазму, одиночные митохондрии, слабо развитую внутриклеточную систему мембран гладкого (ГЭР) и шероховатого эндоплазматического ретику- лума (ШЭР).

0

В процессе преобразования в хлоридные клетки малодифференцированные клетки проходят через стадии светлых и темных клеток.

Светлые клетки характеризуются тем, что они локализуются в толще эпителия жабр, имеют светлую цитоплазму, больщее коли- чесво митохондрий и мембран ГЭР по сравнению с малодифференцированными клетками.

Темные клетки отличаются от светлых электронноплотной цитоплазмой, содержащей больщое количество рибосом, а также тем, что они как и хлоридные клетки дЬстигают поверхности эпителия. Хлоридные

5 клетки связаны с внещней средой, имеют цилиндрическую форму и характеризуются складчатостью апикальной цитомембраны. Стадия серебристой пестрятки (рагг smolt) характеризуется тем, что складчатость апикальной цитомембраны выражена отчетливо и регулярно, появляется ее опу- щенность, между хлоридными клетками появляются десмосомы, а из числа малодифференцированных клеток появляются светлые и темные формы, не достигающие по5 верхности эпителия (Б, поз. 1).

Стадия серебрянки (smolt) характеризуется тем, что хлоридные клетки соединены дес.мосомами и щелевыми контактами, темные клетки достигают поверхности эпителия и образуют складки, которые так же как

0 и у хлоридных клеток покрыты волосками. Способ определения стадий смолтификации у молоди лососевых рыб осуществляют следующим образом.

У исследуемых рыб берут образец жаберных дуг с лепестками, фиксируют 2,5%-ны.м

5 глутаровым альдегидом на 0,1 М какодилат- ноле буфере рН 7,2-7,4 с 3%-ной сахарозой в течение 1,5ч, затем промывают 10-15 мин, вновь фиксируют 1%-ным осмием на то.м же буфере, промывают в течение 10 мин, эти.ч

п буфером, обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, заключают в аралдит, получают срезы, окращивают цитратом свинца и уранилацетатом и полученный препарат просматривают в электронном микроскопе, исследуя ультраструктуру хлоридных

5 клеток. В хлоридных клетках выделяют наиболее активные осморегулирующие зоны, апикальную (поверхностную мембрану) ци- томембрану 1 и межклеточные контакты 2, 4. У молоди лососевых рыб различают следующие стадии смолтификации: пестрят0 ка (рагг), серебристая пестрятка (рагг smolt) и серебрянка (smolt). При наблюдении слабой и не регулярной выраженности апикальной цитомембраны, наличии между хлоридными клетками плотных контактов (А, поз. 2) плотный контакт состоит из нескольких линий слияния (гребешков) между соседними клетками, которые создают барьер для диффузии веществ по точному пространству, надежно изолируя

5

внутреннюю среду от внешней) делают вывод, что молодь достигла стадии пестрят- ки (А).

При наличии отчетливой и регулярной опушенности складчатости апикальной цито- мембраны 1, появлении между хлоридными клетками десмосом 3 и появление из мало- дифференцированных клеток светлых и темных форм, не достигающих поверхности эпителия, делают вывод, что молодь рыбы находится на стадии серебристой пестрят- ки (Б). Это обусловлено тем, что у серебристой пестрятки характер соединений между клетками меняется. Хлоридные клетки взаимодействуют между собой светлыми и темными клетками с помощью десмосом (Б, поз. 3). Десмосомы представляют собой специализированные контактные участки между клетками, характеризующиеся тем. что плазматические мембраны двух контактирующих клеток в десмосомах идут параллельно друг другу и разделены пространством, в котором располагается тонкая пластинка плотного вещества. К внутреннему слою каждой мембраны в десмосомах прилегает электронно-плотное вещество. Такая структура более проницаема для выхода ионов.

В том случае, когда хлоридные клетки соединены десмосомами 3 и щелевыми контактами 4 (последние представляют собой специализированные области межклеточной границы, в которой мембраны соседних клеток идут строго параллельно друг другу. Через эти структуры осуществляется наиболее активный, по сравнению с плотными контактами и десмосомами, межклеточный обмен ионами и метаболитами), а темные клетки достигают поверхности эпителия и их цитомембрана образует складки, которые так же как и складки цитомембраны хло- ридных клеток покрыты волосками, молодь рыбы достигла стадии серебрянки, смолта - физиологической готовности организма к жизни в морской воде (В).

Пример /. У 50 экс. молоди рыб (трех- годовиков), находящихся по внешнему виду на стадии серебрянки, произвели взятие проб жаберных дуг с лепестками, зафиксировали 2,5%-ным глутаровым альдегидом на 0,1 М какодилатном буфере рН 7,3 с 3%-ной сахарозой в течение 1,5 ч, промывали 10-15 мин этим буфером, дофик- сировали 1%-ным осмием (1ч), промывали 12 мин этим буфером, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 70, 80 96, 100%), заключали в эпоксидную смолу аралдит, получали на ультрамикротоме срезы, окрашивали питратом свинца и урани- лацетатом и просматривали в электронном микроскопе хлоридные клетки.

По морфологическим признакам наиболее активных осморегулирующих структур, в частности апикальной цитомембране, наличию и локализации светлых и темных

клеток в толще эпителия, типу межклеточных контактов, определяют стадию смолти фикации. Так из всей партии рыб у 20 экземпляров хлоридные клетки соединены между

собой десмосомами и щелевыми контактами, темные клетки достигают поверхности эпителия и совместно с хлоридными клетками имеют апикальную цитомембрану с глубокими и регулярными складками, которые поQ крыты волосками. Следовательно, по этим морфологическим признакам 20 шт. рыб на- .ходятся на стадии серебрянки.

У 30 экземпляров рыб из этой партии хлоридные КоТетки соединены между собой десмосомами, апикальная цитомембрана

5 имеет отчетливую и регулярную складчатость, в толще эпителия появляются светлые и темные формы клеток, которые не достигают поверхности эпителия. Таким образом, 30 экз. рыб находилось на стадии серебристой пестрятки.

0

Пример 2. Исследовали дикую молодь

семги в количестве 30 экземпляров. По внешним признакам она находилась на стадии серебрянки. Подготовку проб жаберного эпителия для осуществления предлагаемого спо5 соба проводили как в примере 1.

Анализ рыбы предложенным способом показал, что у 11 экземпляров рыб складчатость апикальной цитомембраны была выражена отчетливо и регулярно, проявляля- лась опушенность апикальной цитомембра0 ны, хлоридные клетки были соединены десмосомами, в толще эпителия появлялись светлые и темные клетки.

Эти морфологические признаки свидетельствуют о том, что 11 экземпляров рыб находится на стадии серебристой пестрятки.

5 У 19 экземпляров молоди апикальная цитомембрана имела отчетливо выраженную и регулярную складчатость и опушенность, хлоридные клетки соединялись между собой и темными клетками, которые достигали поQ верхности эпителия при помощи десмосом и щелевых контактов.

Следовательно, 19 экземпляров семги находится на стадии серебрянки.

Примеры подтверждают, что предлагаемый способ позволяет повысить точность

5 установления у молоди рыб той или иной стадии смолтификации.

Повышение точности обусловлено тем, что исследованию подвергают те зоны хлорнд- ных клеток, которые наиболее четко отражают готовность организма к скату.

0 Предлагаемый способ прост в осуществлении и не требует проведения ложных и трудоемких анализов.

Формула изобретения

Способ определения стадии смолтификации у молоди лососевых рыб, включающий взятие у рыб образцов жаберных дуг с лепестками, приготовление из образца препарата для электронного микроскопирования, просмотр препарата с исследованием состояния хлоридных клеток и установление стадии смолтификации молоди рыб на основе этого исследования, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности определения стадии смолтификации, при исследовании состояния хлоридных клеток анализу подвергают их активные саморегулирующие зоны - апикальную цитомембра- ну и межклеточные контакты - и одновременно исследуют состояние малодифференцированных клеток, служащих для образования хлоридных клеток, при этом к стадии пестрятки относят молодь, у которой складчатость апикальной цитомембраны выражена слабо, не регулярно, соседние хлоридные

клетки соединены между собой плотными контактами, малодифференцированные клетки расположены слоем под хлоридными клетками, к стадии серебристой пестрятки отно- ОЯТ молодь, у которой складчатость апикальной цитомембраны выражена отчетливо и регулярно, имеет опущенность, между хлоридными клетками видны десмосомы, а из числа малодифференцированных клеток появились светлые и темные формы, которые не достигают поверхности эпителия, а к стадии серебрянки относят молодь, у которой хлоридные клетки соединены десмосомами и щелевыми контактами, темные клетки достигают поверхности эпителия и их апикальная цитомембрана образует опушенные складки.

Изобретение относится к рыбоводству и направлено на повышение точности и упрощение определения стадий смолтификации у молоди лососевых рыб. Для этого у молоди берут образец жаберных дуг, готовят препарат для электронного микроскопирования и исследуют хлоридные клетки (ХК), а также малодифференцированные клетки (МК), из которых образуются ХК. При исследовании ХК изучают апикальную цитомембра- ну (АЦ) и межклеточные контакты. К стадии пестрятки относят молодь, у которой складчатость АЦ выражена слабо, нерегулярно, соседние ХК соединены плотными контактами, МК расположены слоем под ХК; к стадии серебристой пестрятки относят молодь, у которой складчатость АЦ выражена отчетливо и регулярно, имеет опушенность, между ХК виднь десмосомы, МК содержат светлые и темные формы, не дохоаящие до эпителия; к стадии серебрянки - молодь, у которой ХК соединены десмосомами и шеле- выми контактами, темные клетки достигают поверхности эпителия и их А1 образует опущенные складки. 1 ил. (Л

. . . ,: -. . J4 . и -: ;ч1 ... А/. л. - «.:-. ..-.

/- Т/ 1.--

9 - .-. it, .- V .

А.