Способ определения липидов в сыворотке или плазме крови Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

ее

ч|

VI Ч

00 САЭ

Изобретение относится к биохимии липидов и может быть использовано в медицинеJ в частности в исследовании липидного обмена и патогенеза атеро- склероза.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет предварительного ферментативного гидролиза балластных липидов.

Способ осуществляют следующим образом.

В сыворотке или плазме крови пере анализом липидов методом хроматографии осуществляют избирательный фер- ментативный гидролиз маскирующих ли- пидных компонентов. В зависимости от того, какие липиды необходимо уда-. лить, применяют различные ферменть. Например, для удаления маскирующих пики эфиров холестерина триглицери- дов их гидролизуют липазами до сво- бодного глицерина и жирных кислот. Для удаления зфиров холестерина используют холестеринэстеразу, а для удаления фосфолипидов различные виды фосфолипаз. Образующиеся при ферментативном гидролизе соединения имеют резко отличающиеся от исходных хрома тографичес г ие свойства и уже не ме шают определению нужных липидов.

Исследуемую сыворотку или плазму крови обрабатывают препаратом липо- литического фермента (липаза, холес- терииэстераза или фосфолипаза) , пос- ле чего проводят обычную обработку сыворотки гзеред непосредственно хро- матографическим анализом. На основании площадей отдельных липидов определяют их соогношения,

Пример 1 . 2,5 мкл сыворотки крови человек, смешивают с 5 мкл препарата микробной липазы (удельная aKTHBHoizTb 500 ед/мл по гидролизу коммерческой эмульсии кокосового мае- ла Интралипт-щ фирмы Витрум 8 Изе- ция) и прогревают при 38 С в течение 20 мин. Затем добавляют 300 мкл изо- пропилового спирта, энергично встряхивают, центрифугируют при 3000 об/ми в течение 30 мин, 20 мкл раствора вводят в колонку (4,5x250 мм) для хроматографии в обращенной фазе (Ultraspher ODS, Алтекс, CiM) и проводят элюцию системой растворителей изопропанол - ацетонитрил (65:35 по объему). Детектирование липидов (эфи ры холестерина и стероидов) прово дят при 205-нм„

(О

5 0 5 0

(- 0

0

5

На хроматограммах липидемичаской сыворотки без обработки липазой к после обработки липазой перед экстракцией видно, что индивидуальные хо- рошо разрешенные пики, соответст- вующие эфирам холестерина, полностью замаскированы гораздо более, интенсивными пиками триглицеридов. .Трчность определения этих эфиров без обработки липазой с трудом поддается оценке; во всяком случае, общая погрешность превьтаает 100%. После обработки липазой общая погрешность определения данных эфиров холестерина составила 4-6%.

Концентрация определяемых эфиров холестерина - арахидоната и эфира эйкозапентадиеновой кислоты - составляла в исследуемой сыворотке 0,58- 0,19 ммоль/л соотетственно.

Пример 2.25 мкл плазмы крови человека смешивают с 10 мкл препаг рата микробной холестеринэстеразы (удельная активность 20 ед/мл по гидролизу пальмината холестерина, солю- билизированному лецитином и.таурохо- латом натрия) в буфере, содержащем неионные детергенты (тритон Х-100, Бридж-35 и т.п.), и прогревают при 37 С в течение 30 мин. Затем добавляют 300 мкл изопропилового спирта, . энергично встряхивают, центрифугируют при 3000 об/мик Б течение 30 мин. 20 мкл полученного экстракта вводят в хроматографическуто колонку (456 X 250 мм) для хроматографии в обращенной фазе (Ulti aspher ODS, Алтекс, США) и проводят элюцию в . системе растворителей изопропанол - ацетонитрил (70:30 по объему). Детектирование липидов проводят при 205 нм,

В данном случае повышается точность определения ацилглицеокна, концентрация которых по глицерину 0,18 ммоль/л, Погрешность его определения уменьшается с 10-12 до 5-6%. Изменение времени выхода пикав связано с увеличением полярности гюдвижной фазы.

Пример 3. 30 мкл сыкоротки крови человека смешивают с 10 препарата микробной фосфолипазы (смесь фосфолипаз А., С и D) Удапь- ная активность фосфолипазы составляла 500 ед /мл, фосфолипазы ед/мл, а фосфолипазы D - 35 ед/мл. Огтределе- ние активности фосфолипаз проводилось по гидролизу лецитина.

После добавления препарата фррмен- та сыворотку«нкубируют при 370 С в течение 30 мин, добавляют 300 мкл . изопропанола, энергично встряхивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. 20 мкл пол енного экстракта вводят в колонку для хроматографии (4,6 X 150 мм) с скликагелем и проводят элюцию системой раствори- телей гексан - изопропанол - вода (9:8:1 по объему). Детектирование ли- пидов проводят при 205 нм. Общая концентрация моноглицеридов в исследуемой в данном примере сыворотке сое- тавляла 0,45 ммоль/л по глицерину. Ошибка определения холестерина и ацилглицерина без обработки фосфоли- пазами превьппает 100%, с обработкой составляет 3-5%. Погрешность определения ацилглицерина без обработки ферментами составляет 25-30%, а с обработкой - 4-5%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно повысить точность определения многих нейтральных липидов методом хроматографии в сыворотке или плазме крови: погрешность определения эфиров холестерина в примере 1 снижается с более чем 100 до 4-6%, погрешность определения ацилг лицерина в примере 2 снижается с 10-12 до 5-6%, погрешность определения холестерина и ацклглицерина в

примере 3 снижается с более чем 100 до 3-5%,.ациглицерина в том же примере - с 25-30 до 4-5%, Способ может быть применен для повышения точности анализа любого биологического материала при использовании подходящих для этой цели ферментов,

Формула изобретения

1.Способ определения лип1вдов в сыворотке или плазме крови путем экстракции липидов органическим растворителем с последующей жидкостной хроматографией, отличающийся тем, что, с целью повьшгення точности способа, при определении липидов исследуемого- класса проводят предварительный гидролиз балластных липидов

в пробе.

2.Способ по п.1, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что, с целью определения глицеридов, пробу обрабатывают смесью фосфолипаз

3.Способ по п.1, о т л и ч а ю- , щ и и с я Тем, что, с целью определения эфиров холестерина и стероидов, пробу обрабатывают липазой.

4.Способ по п,1, о т л и ч а ш- щ и и с я тем, что, с целью определения фосфолипидов, пробу обрабатьша- ют хОлестеринэстеразой.

Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повьшение . точности способа. В сьторотке или плазме крови осуществляют избирательный ферментативный гидролиз маскирующих липидных компонентов. Для уделе-, ния маскирующих пики эфиров холесте- . рина триглицеридов их гидролизуют пазами до свободного глицерина и жирных кислот. Затем проводят обработку сыворотки перед хроматографическим анализом и на основании площадей от- . дельных ЛИПИДОВ определяют их соотношения. 3 з.п. ф-лы.