Способ определения холестерина Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 G01N33/92 C12Q1/60 C12Q1/28 C12Q1/46 

Изобретение относится к области ферментативного анализа и может быть использовано в клинических исследованиях при диагностике атеросклероза, диабета, мочекаменной болезни, функциональных расстройств печени и некоторых инфекционных заболеваний.

Известен способ определения холестерина, основанный на измерении скорости выделения пероксида водорода. Определение холестерина данным способом, которой по своей сути наиболее близок к заявляемому изобретению, выполняется следующим образом, Аликвота исследуемого образца, например, сыворотки крови, вносится в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую реакционную смесь следующего состава:

Буферная смесь 0,1 М, рН 5-9 Субстраты пероксидазы Соли желчных кислот 1-20 мМ, Неиснные детергенты - 0,1 - 10 г/л Холестеринэстераза 100 - 30000 ед/л Холестериноксидаза 100 - 30000 ед/л

Пероксидаза 2500 ед/л. Далее проводят регистрацию изменения оптической плотности при температуре 20- 40°С в течение 2-15 мин,

Недостатки рассматриваемого способа определения холестерина заключаются в следующем.

Оптимальные условия проведения реакций гидролиза и окисления не идентичны (не совпадают оптимум рН, температурный оптимум, концентрации детергентов), что приводит к использованию больших количеств ферментов.

Проведение определения холестерина рассматриваемым способом основано на одновременном проведении 3-х последовательных реакций. Исходно в исследуемых образцах содержится как этерифицирован- ный. так и неэтерифицированный холестерин, причем соотношение этих форм холестерина может меняться в зависимости от сыворотки. Кроме того, скорость гидролиза этерифицированного холестерина холе- стеринэстеразой зависит от длины и

00

С

Ivl

iOO

ioo

i.N О О

степени насыщенности остатка жирной кислоты. Поэтому начальная скорость образования пероксида водорода зависит не Только от общей концентрации холестерина, но и от соотношения разных форм холе- стерина в образце, что приводит к снижению достоверности определения.

Целью изобретения является повышение точности определения.

Поставленная цель достигается предложенным способом, заключающимся в том, что исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации состава: не менее 0,01 М буфера с рН 6,5-8, не менее 5 г/л холевокис- лого натрия и не менее 10 ед/л холестери- нэстеразы, инкубируют при температуре 22-55°С не менее 2 мин, после чего аликво- ту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую не менее 0,01 м/л буфера с рН 6,5-8, не менее 2 г/л холевокислого натрия, не менее 0,3 ед/л пероксидазы, не менее 0,5 ед/л холестериноксидазы, не менее 0,08 г/л 4-аминоантипирина и не менее 0,03 г/л 8- оксихинолина, с последующей спектрофо- тометрической регистрацией скорости реакции образования пероксида водорода.

Предложенный способ отличается от известного порядком проведения операций, а именно, разделением стадии гидролиза и экстракции со стадией окисления, что дает возможность осуществлять гидролиз в оптимальных условиях при температуре 25- 55°С не менее 2 мин, а также соотношением реагентов в гидролизующей и окисляющей смесях.

Эти отличия позволяют повысить точность определения и существенно сократить расход реагентов.

Пример 1. Образец сыворотки (0,02 мл) вносят в пробирку с реакционной смесью (0,2 мл), содержащей 0,01 М К-фос- фатного буфера рН 7.0, холевокислого натрия 10 г/л, 30 ед/л холестеринэстеразы из поджелудочной железы. Параллельно в раствор того же состава вносят 0,02 мл стандартного раствора холестерина (5 мМ). Пробы инкубируют 10 мин при 45° С. Затем из каждой пробирки отбирают по 0,1 мл реакционнойсмеси, вносят - в спектрофотометрическую кювету, содержащую 0,7 мл раствора следующего состава: 0,03 М К-фосфатный буфер, рН 7.0, 5 г/л холевокислого натрия, холестериноксидазу (5 ед/л), пероксидазу (20 ед/л), 4-аминоан- типирин (0,16 г/л), 8-оксихинолин (0,20 г/л). Для каждого из образцов измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в течение 2 мин при длине волны 500

нм. Результаты измерений приведены в табл.1,

Концентрацию холестерина рассчиты- 5 вают по уравнению:

холестерин

Ухол

х 5.0 мМ,

где холестерин -концентрацияхолестерина в исследуемой пробе;

Ухол - скорость изменения оптической плотности для исследуемой пробы;

. Уст - скорость увеличения оптической плотности в случае стандартного раствора холестерина.

Пример 2. Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что при анализе стандартной сыворотки (5 мМ) используют различные значения рН при проведении

первой стадии реакции гидролиза. Результаты измерений приведены в табл. 2.

Из полученных данных следует, что оптимальные значения рН для проведения реакции гидролиза составляют 6,5-8,0,

Примерз. Условия эксперимента аналогичны условиям в примере 1, за исключением того, что используют различные кон- центрации холевокислого натрия в гидролизующей смеси. Результаты измерений приведены в . 3.

На основании данных, приведенных в табл. 3, оптимальная концентрация холевокислого натрия в гидролизующей смеси составляет не менее 5 г/л.

П р и м е р 4. Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что изменяют температуру при которой проводится гидролиз (табл. 4).

Из данных приведенных в табл. 4 следует, что полный гидролиз этерифицированно- го холестерина достигается при температуре 20-55°С при концентрации холестеринэстеразы из поджелудочной железы в гидролизующе й смеси 2 мг/мл (активность холестеринэстеразы 0,03 ед/мл).

Пример 5. Условия измерения те же. что в примере 1, за исключением того, что

изменяют концентрацию холестеринэстеразы в гидролизующей смеси. Данные пред- ставлены в табл. 5.

На основании данных, приведенных в табл. 5, оптимальная концентрация холестеринэстеразы составляет не менее 10 ед/л при температуры 45°С и времени гидролиза 10 мин.

Пример 6. Условия проведения реакции аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что изменяют состав реакционной смеси для проведения реакции окисления холестерина: (табл. 6), варьируя концентрацию холевокислого натрия.

Таким образом, оптимальная концентрация холевокислого натрия в реакционной смеси при окислении холестерина составляет не менее 2,0 г/л.

Пример 7. Условия проведения эксперимента такие же как в примере 1, но изменяется концентрация 8-оксихинолина. Результаты измерений представлены в табл. 7 получены для стандартной сыворотки с концентрацией 5 мМ.

Таким образом, оптимальной концентрацией 8-оксихинолина является не менее 0,3 г/л.

Пример 8. Условия измерения те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию 4-аминоантипири- на. Данные, измеренные для стандартной сыворотки 5 мМ, приведены в табл 8.

Из данных, приведенных в табл. 8, следует, что оптимальной концентрацией 4- аминоантипирина является концентрация не менее 0,08 г/л.

Пример 9. Условия эксперимента те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию пероксидазы в реакционной смеси. Данные приведены в табл. 9.

Полученные данные показывают, что оптимальной концентрацией пероксидазы в реакционной смеси является не менее 0,3 ед/л.

Пример 10. Условия эксперимента те же, что в п. 1, за исключением того, что все сыворотки параллельно измеряют и по способу прототипа, а при измерении по заявляемому способу используют концентрации холестеринэстеразы и холестериноксидазы те же, что в прототипе -- 1 ед/мл. При измерении по способу прототипа к 20 мкл образцов сывороток добавляли 2 мл смеси следующего состава:

0,1 М фосфатный буфер рН 6,7

8,6 мМ трибромгидроксибензойная кислота

1,6 мМ 4-аминоантипирин

3 мМ холевокислый натрий

0,1 % полиэтиленгликоль 6000

0,1 % трезит

1000 ед/л холестеринэстераза 1000 ед/л холестериноксидаза 2500 ед/л пероксидаза

Инкубировали при 30°С и через 2 минуты регистрировали фотометрически скорость образования пероксида водорода. В эксперименте использовались следующие контрольные сыворотки: фирмы Boehringer

mannheim PrecHip EL (концентрация холестерина 8,5 мМ), фирмы Labsystem norm (концентрация холестерина 3,7 мМ), sepocont P (концентрация холестерина 4,7 мМ, фирмы Hyland паталогическая (концентрация холестерина 5,0 мМ). Результаты измерений приведены в таблице. 10.

Из приведенных в табл. 10 данных следует, что при измерении по способу-прототипу полученные результаты зависят от

состава липопротеидных комплексов в сыворотках крови, а при измерении по заявляемому способу точность результатов во всех сыворотках одинакова, что свидетельствует о большей точности предложенного способа.

Формула изобретения Способ определения холестерина, включающий инкубацию исследуемой пробы в среде, содержащей буфер, субстрат

пероксидазы, соль желчных кислот, холе- стеринэстеразу, холестериноксидазу и пероксидазу и последующую спектрофо- тометрическую регистрацию скорости образования перекиси водорода, о т л ичающийся тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации, содержащую буфер с рН 6,5-8,0 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 5 г/л, холестериноксидазу не менее 10 ед/л, инкубируют не менее 2 мин при 25-55°С, затем аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету, содержащую буфер с

рН 8,0-8,6 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 2 г/л, пероксидазу не менее 0,3 ед/л, холестериноксидазу не менее 0,5 ед/л, 4- аминоантипирин в концентрации не менее

0,08 г/л и 8-оксихинолин в концентрации не менее 0,03 г/л.

Таблица 1

Использование: медицина, ферментативный анализ. Цель изобретения - повышение точности способа. Сущность изобретения: процесс осуществляют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20-55°С в течение 2-20 минут реагентом, содержащим холе- стеринэстеразу, буферную смесь и детергент, при этом происходит гидролиз этерифицированного холестерина. На второй стадии осуществляют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образования перок- сида водорода. Регистрацию ведут фотометрическим методом.

Таблица2

Таб лицаЗ

Таблиц я 4

Активность холестеринэстеразы, ед/л

3,0

7,5

10,2

15,0

22,0

30,0

45,0

Концентрация холевокислого натрия, г/л в реакции окисления

1,0

2,0

5,5

6,5

8,5

15,0

20,0

Таблицаб

Измеренная величина концентрации холестерина в станд. сыворотке , мМ ( при )

1,5+ 1,20 4,4 + 0,28 4,75 + 0,26 4,95 + 0,20

Таблицаб

Измеренна я величина концентрации холестерина в станд. сыворотке , мМ ( при )

0,6 + 1,90

2,5 + 0,72

4,8 + 0,34

4,85 + 0,24

5,0 + 0,21

4,9 +0,26

4,85 + 0,17

4,9 + 0,22

Таблица

ТаблицаЗ

ТаблицаЭ

Таблица 10