Способ определения общего холестерина в сыворотке крови Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

ф

00 Изобретение относится к области медицины, -1 именно к способу опреде ления общего холестерина или связанного холестерина в сыворотке - i крови. Известен способ определения обще го холестерина в сыворотке крови пу тем воздействия на пробу холестерин эстеразой с последующим измерением холестерина после обработки холестеринэстеразой lj . Цель изобретения - повьшение точ ности определения. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения общего холестерина в сыворотке крови путем воздействия на пробу холестеринзстеразой с последующим 1змерением холестерина после обработки холестеринзстеразой, в качестве холестеринэстеразы использую ацетоновый сухой порошок или обогащенную холестеринэстеразную фракцию микробной массы Candida rugosa АТС С 14830 или Rhisopus spec. (WC 90027), которую берут в соотношении 1 - 10 ч. на 1 мл сыворотки. Способ осуществляют следующим образом. Используют холестеринэстеразу из Candida rugosa (называемой также .Cylindracea) АТСС 14830 или WC 9003 и Aspergillus spec. WS 90030. Оба эти микроорганизма могут применятьс непосредственно или в растворенной форме, например, какацетоновый сухой порошок. Возможно применение препарата, насьщенного холестеринэстеразой, из этих микроорганизмов причем преимущественно состоит в том, что простым путем можно достич определенного насыщения. Обычная форма представляет собой стабилизированный лактозой ацетоновый сухой порошок. Подобные благоприятные свойства найдены у следующих препаратов:Actinomyces aureoverticiliumWS 90002 Actinomyces cyaneofuscatusWS9U003 Actinomyces griseomyciniWS90004 Actinomyces LongisWS90005porus-fl Actinomyces malachiWS90006Actinomyces roseolus WS900U7 Actinomyces toxytriciniWS 90008 Actinomyces variabilisWS 90009 WS 90010 Streptomyces spec. Streptomyces autotrophicusWS 90011 Streptomyces canesWS 90012 cens Streptomyces chartreusisWS 90013 Streptomyces michiganensisWS 90014 Streptomyces murinus WS 90015 Streptomyces hachijoensisWS 90016 Streptomyces caelesWS 90017 tes Streptomyces tendae WS 90018 Nocardia rubra WS 90019 Candida mycoderena WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans 90022 Candida albicans 90023 Candida spec. WS 90024 Cunninghamella eleWS 90025 gans Mucor mucedo WS 90026 Rhizopus spec. WS 90027 Penicillium spec. WS 90028 Aspergillus spec. WS 90029 Наряду с предпочтительными холесинэстеразами микробиологического исхождения могут применяться же холестеринэстеразы другого исхождения. Преимущество способа сосотоит в , что возможно полное ферментативопределение общего холестерина. этом имеет значение то, что при ощи препаратов холестеринэстераиз микроорганизмов возможно бысти количественное освобождение хотерина из его сложных эфиров. астности, при помощи указанных роорганизмов можно добавлением ледних достигнуть в течение неських минут количественного высождения холестерина. Установлено, обычные стабилизаторы на основе евода, которые применяют для их микроорганизмов, в рамках ментативного способа определения : естерина не влияют на результат еделения. Для осуществления способа можно менять обогащенную холестеринеразу, преимущественно из микроорганизмов. Соответствующее обогащение можно достигнуть исходя из ацетонового сухого порошка микроорганизма или другого биологического материала, подвергая его диализу, обработке слабоосновной.анионообмен ной смолой и фракционированию с сульфатом аммония. Таким путем легк достигают 20-30-кратное обогащение холестеринэстеразы. Особенно благоприятные результаты получены с микроорганизмами, которые выращивались на содержащей холестериновый эфир питательной сре де . При этом холестериновый эфир или смесь холестериновых эфиров может добавляться во время выращива ния как единственный источник углерода или применяться вместе с други источником углерода. Особенно предпочтительны микроорганизмы, которые получены многостадийным способом . культивирования, причем они культивируются в первой стадии на соответствующем поставщике углерода, как глицерин, и во второй стадии на холестериновом эфире. Хрлестеринэстераза из Candida rugosa АТСС-14830 имеет в слабокислой области между рН 5 и 6,5 . очень хорошую стойкость. Оптимум рН фермента 7,5. Характерная особеннос фермента заключается в том, что осо бенно каталитическая реакция происх дит при сравнительно высоком содержании соли в реакционной среде. Поэтому преимущественно работают с буферным раствором 0,2-0,8 М, особенно 0,4-0,6 М. Величина рН может быть 4,5-7,5, преимущественно 5-6,5 Активность холестеринэстеразы повьшается при добавлении поверхностно-активных веществ, особенно гидро ксиполиэтоксидодекана. Последующее определение холестерина производят ферментативно, .преимущественно с применением холесте- риноксидазы. Можно применять также холестериндегидразу или холестериядегидрогеназу. Определение посредством холестериноксидазы по известному способу можно комбинировать с данным способом. При этом можно измерять расход кислорода, образование H.jOj или образование холестенона. Расход кислорода можно определят напримеру методом газовой хроматогр фии, полярометрическим или поляризационным методами. Образованную перекись водорода,можно определять титрометрическим, потенциометрическим, полярографическим и колориметрическим методами, а также ферментативным. Предпочтительно ферментативное определение с применением каталазы или пероксидазы, особенно определение посредством каталазы в присутствии/3-дикетонов, как ацетилацетон, низших спиртов и содержащего ионы аммония буферного раствора или определение посредством пероксидазы в присутствии хромогена, как 2,2-аминобензтиазолинсульфокислота. Колестенон определяется при помощи кетореактивов, например 2,4-динитрофенилгидразина, или фотометрическим методом при 240 нм. Пример 1. В сыворотке с применением известного способа определяют содержание свободного- холестерина 63 мг % (63 мг в 100 мл). Для определения связанного холестерина сравнительную пробу сыворотки обрабатывают при 70 С раствором едкого кали в спирте. После нейтрализации и повторного измерения имеющегося холестерина получают общее содержание холестерина 181 мг %. Отсюда следует, что 118 мг холестерина 100 мл бьши в связанной форме. Способ повторялся с необработанной сывороткой, однако к началу определения добавляли 0,3 мг (в пересчете на протеин) Candida rugosa АТСС 14830 - сухого .ацетонового порошка в торговой форме. Через 3 мин полярографическое определение показало содержание общего холестерина 183 мг%. Пример 2. Для увеличения активности холестеринэстеразы аце-тоновый сухой порошок Candida rugosa АТСС-14830 растворяют в буферном растворе с фосфатом калия при рН 6,0 и подвергают диализу-относительно того же буферного раствора. После удаления содержшцейся в качестве стабилизатора лактозы в подвергнутом диализу растворе получают специфическую активность холестеринэстеразы 0,3 ед/мг протеина. ПолученньЕй таким путем раствор смешивают с модифицированными rjpynпами диэтнла шноэтанола ионообменником на основе декстрана, ионит отделяют и элюируют при помощи 0,2 М буферного фосфатного раствора при рН 6,0. В элюате получают специфическую активность холестерин эстеразы 1,2 ед/мг. Полученный таким путем рартвор подвергают фракционированию с сульфатом аммония. Осаждающую протеиновую фракцию между 1,8 и 2,4 М сульфатом аммония отделяют. Она имеет специфическую активность холестерин эстеразы 2,5 ед/мг. Полученный таким образом продукт снова растворяют в фосфатном буферном растворе с рН 6,0, подвергаю диализу относительно того же буферного раствора до удаления соли и затем хроматографируют на колонне, заполненной такой же анионообменной смолой, как указано. Снова производят элюирование посредством 0,2 М фосфатного буферного раствора с рН 6,0. Во-фракции с активностью холестеринэстеразы получают специфиче кую активность 7 ед/мг протеина. Полученный таким путем обогащенный препарат холестеринэстеразы при меняют для определения холестерина. Однако введенное количество только 0,001 мг в пересчете на протеин. Результат соответствовал примеру 1. П .р и М е р 3. К 0,5 мл сыворотки или холестеринового эталона добавляют 1,0 мл 0,5 М буферного раствора с фосфатом калия при рН 7,5, который содержит О,,4% гидрокси полиэтоксидодекана, и 2,5 ед холестеринэстеразы по примеру 2. Эта реакщюнная смесь инкубируется в течение 40 мин при . После этого 0,25 мл этого раствора добавляют к 3 мл холестеринового реактива, который содержит 2 ч. уксусной кислоты, 3ч. уксусного ангидрида и 1 ч. кислоты (реактив Либермана-Вурхардта). Используя эталон как сравнительную величину, для типичной пробы на ходят 170 мг% общего холестерина. Сравнительное определение при омылении холестериновых зфиров посредством раствора едкого кали в спирте дает величину 165 мг%. Пример 4. 0,02 MJ| сыворотки смешивают с 10 мл 0,5 М буферного раствора с фосфатом кальция, который содержит 0,4% гидрокси полиэтоксидодекана, и 0,2 ед холес3теринэстеразы по примеру 2. Реакционный раствор инкубируют 60 мин при . После этого определяют экстинкцию (Е) при 240 нм по показаниям соответствующего спектрофотометра, реакция начиналась с 0,1 ед стериндегидразы из Brevibacterium sterolicum. Через 15 мин снова считывают по прибору экстинкцию (Ej). Концентрация образованного Д -холестенона и холестерина получается из разности между первым и вторым отсчетом, учитьшая молярный коэффициент экстинкции для Д -холестенона при 240 нм. Измерение. типичной пробы показало 183 мг% общего холестерина. Сравнительное определение с холестериноксидазой (из Nocardia erythropolis) вместо стериндегидразы давало 181 мг% общего холестерина. Пример 5. Юг диаммонийгидрофо.сфата растворяют в 100 мл воды и при помощи 85%-ной фосфорной кислоты устанавливают величину рН 7,0. Затем добавляют 10 ед каталаэы. Полученным таким путем раствором доливают до 100 мл смесь 0,2 мл ацетилацетона, 10 мл метанола и 0,1 г гидроксиполиэтоксидодекана. В этот раствор добавляется 2,5 ед холестеринэстеразы из Rhizopus spec. (WS 90027). 5,0 мл полученного таким путем раствора смешивают с 0,02 мл сьюоротки или 0,02 мл холестеринового эталонного раствора с содержанием 200 мг% холестерина. Делящиеся без остатка количества содержащей сыворотку и содержащей холестериновый эталонный раствор пробы смешивают каждое с О,1 ед холестериноксидазы и инкубируют 60 мин при . Затем красящее вещество измеряют при 405 нм фотометром, учитывая холостую величину пробы. Содержание холестерина в содержащей сыворотку пробе, учитывая эталон как сравнительную величину, 154 мг% всего холестерина. Контрольное определение посредством холестеринэстеразы из Candida rugosa АТСС 14830 вместо холестеринэстеразы из Rhizopus spec. (WS 90027) давгшо такую же величину. 7 Способ позволяет быстро и точно определить содержащее связанного холестерина в биологической жид- 11681038 . кости, при этом возможно определение холестерина, связанного в сложные эфиры.

С1ЮСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОНЦЕГО ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ путем воздействия на пробу холестеринэстеразой с последующим измерением холестерина после обработки холестериноксидазой, отличаю щийс я тем, что, с целью пов1 ш1ения точности определения, в качестве холестерйнэстеразы используют ацетоновьй сухой порошок или обогащенную холестерннэстеразную фракцию микробной массы Candida rugosa АТС С 14830 или Rhisopus spec. (WS 90027), которую берут в соотношении 1 - 10 ч. на 1 мл сыворотки. § О)