Реактив для определения общего холестерина в сыворотке крови Советский патент 1980 года по МПК A61B10/00 G01N33/16 

(54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ но применять вместе с другими источ никами углепода. Особенно предпочти тельно применение микроорганизмов, которые получают по многостадийному способу вырагаивания, причем выращив ние в первой стадии пооизводят на пригодных источниках углерода (глицерин) и во второй стадии - ни слож ных эфирах холестерина. Применение холестеринэстеразы и Candida rugosa AflCC 14830 в слабо кислой форме, рН 5-6,5 показывает высокую стабильность. Оптимальное рН фермента 7,5. Активность холесте ринэстеразы повышается путем добавки поверхностно-активных веществ . Особенно предпочтительна добавка :гидроксиполиэтоксидодекана. Определение холестерина происходит ферментацией при применении хьлесте1 иноксидазы, но можно также применять холестериндегидразу или холестерйндёгидрогеназу. Ферментативное определение общего или связанного холестерина бсудествляют с помощью холестеринок сйдазы, пр едпочтите ль но применяют холестериноксидазу из Nocardia erythropoeis AMCC 17895, Nocardia erythropoEis AMCC 4277,Nocardia formica AMCC 14811 или Proactinomyc er thrppoCis IB 9158. Предпочтительным реактивом является реактив, состоящий из холёсте рйнйксидаэы, препарата холёстеринэстераз:ы из микроорганизмов, катала зы, ацетилацетона, метанола и содержащего ионы аммония буфера, взятых по отдельности или в смеси. Реактив также может состоять из холестериноксидазы, препарата из микроорганизмов с активностью холестёринэЬтеразы, пероксидазы, хромогена и буфера в отдельности или в смеси. В качестве хромогена используют 2,2 -аминобензтиазрлинсульфо.кислоту. . / Реактив также может состоять из холестериноксидазы, препарата холестеринэстеразы и производного гид разина, реаги)Ьующего с кетогруппами с образованием идразона, атакже буфера. В качестве производного гид Разина используют 2,4-динитрофенилгиДразин. Кроме того, реактив может дополнительно содержать растворители, ст билизаторы и поверхностно-активные вещества. Предпочтительно реактивы содержа следующие компоненты: 1. ХолестеринсЭксидаза13-150 ед./мг Холестерин эстераза из - микрЪбрганизма .. 0,05-0,5 мг . Каталаза 2 10 --5-10 ед. Ацетилацетона 0,05-0,2 мл Метанол 2-10 мл в 100 мл буфена,содержащего ионы аммоии я; рН 5-7. Гидроксиполиэтоксидодекан 0,02-0,3 мл 2.Холестериноксидаза . 3-40 ед./мг Холестеринэстераза из микроорганизма0,05-0,5 мг Пероксидаза 2-10 -140 2,2-Аминобензтиазолинсульфокислота 50-200 мг Гидроксиполиэтоксидодекан0,05-0,5 мл в 100 мл буфера с рН 6-8 3.Холестерин-; оксидаза 0,1-1,0 ед. Холестёринэстераза из микроорганизма О,О5-0., 5 мг 1 мм раствор 2,4-динитрофенилгидразина 1-5 мл ПАВ0,005-0,1 мл В 10 мл буфера с рН 6-8. 4.Холестериноксидаза 2-100 ед. Холестеринэстераза из микроорганизма 0,05-0,5 мг ПАВ (гидрокси полиэтоксидодекан 0,1-2,0 мл в 50 мл буфера с рН 5-9. С помощью предложенного реактива можно осуществлять быстрое и полное омыленке связанного холестерина. Например, при условиях определения холестерина с помощью холестериноксидазы достигают количественное расщепление связанного холестерина в течение 1-3 мин при добавке сухого порошка из ацетона Candida rugosa AMCC 14830 или AspergiE€us spec. WS .90030 в количестве 0,1-0,3 мг. Пример 1.В сыворотке крови определяют содержание свободного холестерина до 63% (63 мг. в 100 мл)-.Для определения связанного холестерина сравнительную пробу сыворотки крови обрабатывают в течение 30 мин спиртовым раствором едкого, кали при 70С. После нейтрализации и нового измерения имеющегося холестерина получают общее содержание холестерина 181 мг%. Получается, что 118 мг холестерина/ 100 мл находятся в связанной форме. Способ с необработанной, сывороткой повторяют, но в начале определения добавляют 0,3 мг (по отношению к протеину) сухого порощка из ацетона Candida rugosa AMCC 14830 в стандартной форме. Через 3 мин полярографическое определение дает содержание общего холестерина 183 мг %.

Пример 2. Для повыизния активности сложных эфиров холестерина стандартный сухой порошок из ацетона Candida rugosa AMCC 14830 растворяют в буфере из фосфата калия с рН 6,0 и диализуют по отношению к такому же буферу. После удаления лактозы, содержащейся в качестве стабилизатора, получают уделную активность холестеринэстеразы 0,3 ед./мг протеина в диализованном растворе.

Полученный раствор смешивают с ионитом на основе декстрана, модифицированным диэтиламиноэтанольными груп17ами, ионообменник отделяют и элюируют О,2 М фосфатным буфером с рН 6,0. В элюате получают удельную активность холестеринэстеразы 1,2 ед./мг. .

Полученный раствор подвергают фракционированию сульфатом аммония. Выпавшую между 1,8 и 2,4 М сульфата аммония протеиновую фракцию отде- ляют. Она показывает удельную активность холестеринэстеразы 2,5 ед./мг

Полученный продукт снова растворяют в фосфатном буфере с рН 6,0, диализуют по отношению к такому же буферу вплоть до обессоливания и затем хроматографируют через колонн которая заполнена таким же анионитом, как указано выше. Опять проводят элюирование с помощью 0,2 М фосфатного буфера с рН 6,0. Во фракции удельная активность холестеринэстеразы достигает 7 ед../мг протеин

Полученный обогащенный препарат холестеринэстеразы применяют для определения холестерина, как описан в примере 1. Примененное количество -составляет лишь 0,001 мг по отношению к протеину. Результаты соответствуют результату примера 1.

Холестеринэстеразу и.з Candida rugosa можно очистить обычным способом ТОНКОСЛОЙНОЙ хроматографией. Вместо стадий обогащения можно применить биохимические стадии очистки например, осаждение или фракционирование с помощью полиэтиленимина, органичестсих растворителей или солей, хроматографии через материалы молекулярных сит или более слабые анионообменники с другими функциональными группами, чем диэтиламиноэтанольные группы, оса):Дение с помощью протаминсульфата. .

Дример 3. К0,5мл сыворот|ки крови или стандартному холестерину добавляют 1,0 мл 0,5 М буфера на основе фосфата калия с рН 7,5, KpTdрый содержат 0,4% гидроксиполиэтоксидодекана и 2,5 ед./мг холестеринэстер азы, согласно примеру 2.

Эту реакционную смесь инкубируют в течение 40 мин при З7с. Затем .

0,25 мл этого раствора добавляют к 3 мл реактива на холестерин, который содержит две части уксусной кислоты, три -тасти уксусного ангидрида и одну часть серной кислоты (реактив Либермана-Бурхардта).

При использований стандарта в качестве относительной величины для типичной пробы найдено 170 мг % общего . холестерина. Сравнительное определение при омылении сложных эфиров холестерина спиртовым раствором едкого кали дает 16 5 мг %.

Пример 4, 0,02мл сыворотки крови смешивают с 10 мл 0,5 М буфера на основе фосфата калия, который содержит 0,4% гидроксиполиэтоксидодекана и 0,2 ед/мг холестеринэстеразы, по примеру 2.

Реакционный раствор инкубируют 60 мин при . Затем высчитывают

0 экстинкцию Е при 240 нм в пригодном спектрофотометре и реакция начинается с помощью 0,1 ед/мг стериндегидразы из Brevibacterium steirolicum. Через 15 мин снова определяют экстин5 кцию Eg- Концентрация образовавшегося д -холестенона и вместе с этим холестерина получается из разницы между первым и вторым определением

с учетом молярного коэффициента экстинкции д-ля д -холестенона

при 240 нм. Измерение типичного образца дает 183 мг % общего холестерина. Сравнительное определение с помощью холестериноксидазы (из Nocardia erythropotis) вместо стериндегидразы дает 181 мг % общего холестерина.

Пример 5. Юг диаммонийгидрофосфата растворяют в 100 мл воды и с помощью 85%-ной фосфорной кислоты устанавливают рН 7,0. Затем добавляют 10 ед./мг каталазы. С помощью полученного раствора смесь из 0,2 мл ацетилацетона, 10 мл метанола и 0,1 г гидроксиполиэтоксидо-,

декана доводят до 100 мл. К этому раствору добавляют 2,5 ед./мг холестеринэстеразы из Rhizopus spec. (WS 90027) , 5 мл полученного раствора смешивают с 0,02 мл сыворотки или 0,02 мл стандартного раствора

холестерина с содержанием 200 мг % холестерина. Аликвотные части об- разца, содержащего сыворотку и также стандарт холестерина, смешивают, с О,1 ед/мг холестериноксидазы и инкубируют 60 мин при З7с. Затем полученный краситель измеряют фотометрически при 405 нм с учетом значений контрольных образцов.

Содержание холестерина в содержащем сыворотку образце составляет при использовании стандарта в качестве относительной величины 154 мг % общего холестерина. Контрольное определение с помощью холестеринэстеразы из Candida rugosa AMCC 14830 вместо холестеринэстеразы из Rhi opus spec. (WS 90027) дает такое же значение. Предлагаемый реактив повыиает точность определения общего холесте рина в сыворотке крови. Формула изобретения Реактив для определения общего х лестерина в сыворотке крови, о т л ч S( ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности определения, он содержит холестеринэстеразу, холестериноксидазу, каталазу, ацетилаце тон, метанол, детергент и аммиачный ер при следующем соотношении коментов, вес.%: Холестерин0,05 . 10 эстераза Холестерин10-б . оксидаза 10 -10 Каталаза 10-2- Ацетилацетон 5 Метанол 2,0-10,0 2,0 .10-2-1,01 Детергент Амг иачный Остальное Источники информации, нятыё во внимание при экспертизе 1, Предтеченский В. Руководо по клиническим лабораторным исдованиям. М., 1964, с. 223-224.