Способ выделения митохондрий из сердечной мышцы Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

20

Изобретение относится к медицине Н биологии, а именно к способам получения митохондрий, используемых для исследования энергетического состояния клетки в условиях воздействий химических веществ.

Цель изобретения - повышение фи- эиологичности и упрощение способа.

Способ осуществляется следуюпщм образом.

Выделяют кусочек мышечной ткани. Помещают его в охлажденную до 0-4°С Среду 1. В этой среде ткань расщепляют пинцетами на отдельные пучки ве- COM 1-2 мг. Группу из 5 пучков волокон инкубируют при 0-4°с в 1 мл среды 1 с добавлением 40-60 мкг/мл сапонина в течение 20 мин при интенсивном перемешивании. Затем препараты инкубируют в 1 мл среды 2 с перемешиванием а течение 1 мин, также на холоде. Состав среды 1 - имидазол 20 мМ, MgCl, 9,5 мМ, АТР 5,3 мМ, (фосфокре- атин 15 мМ, К,ЭГТА 8,1 мМ, К,СаЭГТА 1,9 мМ, глутамат 5 мМ, малат 2 мМ, рН 7,0,

Концентрации: магния 3 мМ, кальция О,1 мМ. Состав среды 2 - имидазол 20мМ, MgCl 4 мМ, КН,Р04 3 мМ, . ЗО 8,1 1, К СаЭГТА 1,V мМ, глутамат 5 мМ, малат 2 мМ, дитиотреитол 0,5мМ, таурин 20 мМ 2(р-морфолино)этансуль- фонат зрсалия 100 мМ, рН 7,0. Концентрации: магния 3 мМ, кальция 0,1 мМ.

Определение поглощения кислорода.

Подготовленные таким образом препараты (3-7 мг) помещали в полярографическую термостатированную ячейку, снабженную магнитной мешалкой и за- яолненкую 1-3 мл среды 2. В ячейку вводили электрод Кпарка и поглощение кислорода регистрировали на оксимет- ре фирмы Yellow Spring Instruments (USA) с самописцем Linear. Чувствительность прибора - 230 мг-атом/мл кислорода на полную шкалу прибора, скорость движения бумаги 1 см/мин.

После помещения в ячейку препарата скинированных эолокон и введения кислородчувствительного электрода последовательно через 3-4 мин к ним добавляют субстраты (2 lA мапата, 4 мМ глутамата-), 60 мкМ АДФ, 20 мМ креатина, 1 мМ АДФ, 50 мкМ карбоксирассчитывают по формуле V А-В/С, где А - растворимость кислорода, нг-атом/мл; В - скорость движения пера самописца, см/мин; С - ширина шкалы самописца, см. Полученные скорости относят к сырому весу волокон, а также к общему содержанию белка в препарате, измеренному методом Лоури

1Q Данные измерений позволили выбрать оптимальный режим обработки ткани (20±5 мин, концентрация сапонина 40-60 мкг/мл).

В табл. 1 приведена зависимость влияния времени обработки и концентрации сапонина на полноту скинирова- ния и дыхательный контроль.

Пример 1. При добавлении в оксиграфическую ячейку 6,1 мг скинированных волокон (0,75 мг общего бел ка) скорость поглощения кислорода бе субстратов - 0; после последовательньпс добавок 2 мМ мапата и 4 мМ глута мата - 1,387 нг-атом Оа/мин мг сырог

25 веса или 11,75 нг-атом 02/мин мг белка; 60 мкМ АДФ - соответственно 1,988 и 16,84; 20 мМ креатина - 2,59 и 21р9; 1 мМ АДФ - 6,01 и 50,92; 50 мкМ КАТ - 2,03 и 17,2; при замене КАТ на ротенон - 0,42 и 3,55; при за мене КАТ на антимицин - 0,29 и 2,45; при замене КАТ на азид натрия - 0,32 и 2,71. Таким образом, проводится оценка функционального состояния митохондрий в составе скинированных волокон сердечной ткани, в том числе работа системы окислительного фосфо- рилирования, цепи переноса электрот- нов, креатинкиназной системы, транс35

40

45

50

порта метаболитов, а также интакт- ность митохондриальной мембраны.

Всего исследовано 10 проб, дыхательные характеристики скинированных волокон из сердца крысы представлены в табл. 2 (стандартная ошибка способ 7-8%). Отсутствие дыхания без мито- хондриальньрс субстратов малата и глутамата, а также полное подавление дыхания в присутствии ингибиторов цепи переноса электронов (таких как ротенон, антимицин, азид натрия) показывает, что поглощение кислорода обусловлено только функционированием митохондрий. Высокая скорость АДФ- и креатинстимулируемого дыхания

атрактилозида (КАТ), 20 мкМ ротенона, 55 (152 нг-атом/мин для АТФ-стимулиру0

О

рассчитывают по формуле V А-В/С, где А - растворимость кислорода, нг-атом/мл; В - скорость движения пера самописца, см/мин; С - ширина шкалы самописца, см. Полученные скорости относят к сырому весу волокон, а также к общему содержанию белка в препарате, измеренному методом Лоури.

Q Данные измерений позволили выбрать оптимальный режим обработки ткани (20±5 мин, концентрация сапонина 40-60 мкг/мл).

В табл. 1 приведена зависимость влияния времени обработки и концентрации сапонина на полноту скинирова- ния и дыхательный контроль.

Пример 1. При добавлении в оксиграфическую ячейку 6,1 мг скинированных волокон (0,75 мг общего белка) скорость поглощения кислорода без субстратов - 0; после последователь, ньпс добавок 2 мМ мапата и 4 мМ глутамата - 1,387 нг-атом Оа/мин мг сырого

5 веса или 11,75 нг-атом 02/мин мг белка; 60 мкМ АДФ - соответственно 1,988 и 16,84; 20 мМ креатина - 2,59 и 21р9; 1 мМ АДФ - 6,01 и 50,92; 50 мкМ КАТ - 2,03 и 17,2; при замене КАТ на ротенон - 0,42 и 3,55; при замене КАТ на антимицин - 0,29 и 2,45; при замене КАТ на азид натрия - 0,32 и 2,71. Таким образом, проводится оценка функционального состояния митохондрий в составе скинированных волокон сердечной ткани, в том числе работа системы окислительного фосфо- рилирования, цепи переноса электрот- нов, креатинкиназной системы, транс5

порта метаболитов, а также интакт- ность митохондриальной мембраны.

Всего исследовано 10 проб, дыхательные характеристики скинированных волокон из сердца крысы представлены в табл. 2 (стандартная ошибка способа 7-8%). Отсутствие дыхания без мито- хондриальньрс субстратов малата и глутамата, а также полное подавление дыхания в присутствии ингибиторов цепи переноса электронов (таких как ротенон, антимицин, азид натрия) показывает, что поглощение кислорода обусловлено только функционированием митохондрий. Высокая скорость АДФ- и креатинстимулируемого дыхания

Изобретение относится к медицине и биологии. Точнее - к способам получения митохондрий, используемых для исследования энергетического состояния клетки в условиях воздействий химических веществ. Цель изобретения - повышение физиологичности и упрощение способа. Для этого вьщеля- ют кусочек мьпвечной ткани, помещают его в охлажденную до 0-4°С среду № 1 (имидазол 20 мМ; MgCl 9,5 мМ; АТР 5,3 мМ; фосфокреатин 15 мМ; К7.ЭГТА 8,1 мМ; К СаЭГТА 1,9 мМ; глутамат 5 мМ; малат 2 мМ, рН 7,0). В этой, среде ткань расщепляют на отдельные пучки по 1-2 мг. Группу из пяти пучков, волокон инкубируют при 0-4 С в 1 мл среды № 1, добавляя 40-60 мкг/мл спонина 20 мин при интенсивном перемешивании. Затем препараты, перемешивая, инкубируют в 1 мл среды № 2 10 мин также на холоде (состав среды № 2: имизадол 20 мМ; MgCl 4 мМ; КН,Р04 3 мМ; К ЭГТА-8,1 мМ; КгСаЭГТА 1,9 мМ; глутамат 5 мМ; малат 2 мМ; димитреитол 0,5 мМ; таурин 20 мМ; 2(|5,-морфолино) этансульфонат калия 100 мМ; рН 7,0). Концентрация магния в обеих средах по 3 мМ, кальция - 0,1 мМ. Определяют поглощение кислорода, помещая подготовленные препараты в поляриграфическую ячейку со средой № 2 и магнитной мешалкой. В ячейку вводят электрод кларка и регистрируют поглощение кислорода на -оксиметре, через каждые 3-4 мин добавляя субстраты (2 мМ малата, 4 мМ глутамата), 60 мМ АДФ, 20 мМ креатина, 1 мМ АДФ, 20 мМ креатина, 1 мМ АДФ, 20 мМ.креамина, 1 мМ АДФ, 50 мМ карбоксиатрактилозида (КАТ), 20 мМ ротенона, 10 мкг/мл антимицина, 1 мМ азида натрия. Анализируют скорость поглощения кислорода, относят их к сырому весу волокон и к общему содержанию белка в препарате и выбирают оптимальный режим обработки ткани. 2 табл. (С (Л со СХ) о:) со

10 мкг/мл антимицина, 1 мМ азида натрия. Параллельно анализируют скорости поглощения кислорода. Эти скорости

емого дыхания в пересчете на мг мито- хондриального белка) близка в тех же условиях к скорости дыхания наиболее

интактной фракции изолированных митохондрий (160-165 нг-атом/мин на мг) , что свидетельствует о нормальной работе митохондрий в составе скиниро- ванных волокон мышечной ткани. Данные электронной микроскопии и высокая степень ингибирования КАТ, равная 70% (табл. 2), показывают наличие интактной митохондриальной мембраны, Таким образом, митохондрии в составе скинированных волокон по их отношению к митохондриальным субстратам, ингибиторам, а также по их морфологии

являются интактными митохондриями, Кроме того, измерение содержания в скинированных волокнах цитохрома аа, равного 20,6il,8 нмоль/г сырого веса, показало, что в полученных волокнах сохраняется вся популяция митохондрий (содержание цитохрома в .ткани 21,011,5 нмоль/г).

Известно, что дахательные параметры митохондрий, выделенных из мышеч- ной или сердечной ткани, существенно ухудшаются при различных видах патологии. Было оценено изменение пара- метров дыхания скинированных волокон

сердца крысы при тотальной ишемии 1 о

15

и 30 мин при (без реперфузии) и при катехоламиновой перегрузке, вызванной введением 80 мг/кг веса изо- преналина.

Концентрация сапонина (время 20 мин), мкг/мл

30

40

50

60

100

250

Уменьшение содержания лактатдегидрогеназы (ЛДГ) отражает степень снятия клеточной мембраны.

Q

5

0

5

0

Пример 2, При добавлении в оксиграфическую ячейку 4,1 мг скинированных волокон сердца, подвергнуто го 30 мин ишемии, скорость поглощения кислорода после последовательных добавок 4 мМ глутамата и 2 мМ малата - 1,38 нг-атом О2/мин на мг сырого веса или 13,43 нгг-атом на мг белка; 60 мкМ АДФ соответственно - 1,65 и 16,11; 20 мМ креатина - 1,79 и 17,46; 1 мМ АДФ - 3,14 и 30,9; 40 мкМ КАТ - 1,81 и 17,7,

Как йидно из примеров 1и 2 результаты измерения дыхательных характеристик скинированных волокон указывают на нарушения в функционировании митохондрий сердца при патологии и, следовательно, на нарушение энергоснабжения сердечной клети, что дает возможность применения указанного метода в диагностических целях.

Формула изобрет е-н и я

Способ выделения митохондрий из сердечной мышцы, включающий разрушение сарколеммы н ионной среде, о т- личающийся тем, что, с целью повышения физиологичноети и упрощения способа за счет сокращения стадий процесса, разрушение проводят обработкой сапонином в концентрации ,40-60 мкг/мл в течение 15-25 мин, , Таблица 1

V /V ЛВ Р о

2,60 2,98 2,88 3,05 2,50 1,86

ИГНАТОМ Of

мп-мг бшисс

IS,5tt,3 20,4tl,e 27,1t2,6 55,.0 18,0t1,5 ,,2 0,34iO,04

QI

Mm Mr е1фого tc«

1,etO,14 2,4ltO,f8 3,2tO,2 6,,42,ltO,t7

Табляаа 2