Способ определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования системы окислительного синтеза АТФ Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к биохимии и к биофизике, а именно к биоэнергетике.

Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Сравнительное определение управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования графическим и аналитическим методами.

Выделяют митохондрии из мозга крыс самцов общепринятым методом дифференциального центрифугирования. В холодной камере (0-4°С) животных декапитируют, извлекают из черепной коробки полушария головного мозга и помещают их в стакан объемом 100 мл, заполненный охлажденной

(0°С) средой выделения следующего состава: сахароза - 250 мМ, трис 2,5 мМ, трис-НС 8,5 мМ, ЭДТА 1 мМ, рН 7,4. Затем полушария головного мозга очищают от мозговых оболочек и кровеносных сосудов, промывают и гомогенизируют с помощью тефлоно- вого пестика со скоростью 200 об/мин, произведя 10 движений пестиком вниз- вверх. Гомогенат разводят до соотношения 1:10 и центрифугируют 10 мин при 1000 д. После этого надосадочную жидкость осторожно сливают в стакан, разливают по пробиркам и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 д.

Потребление кислорода измеряют по- лярографически с помощью открытого платинового электрода. Применяют инкубао

CJ

vj 00

ционную среду следующего состава: сахароза 250 мМ, KC115 мМ. трис 10 мМ, КНаРСм 20 мМ, ЭДТА 0,5 мМ, рН 7,4. В качестве субстрата дыхания используют 15 мМ глута- мат. После прекращения дрейфа электрода в полярографическую ячейку добавляют суспензию митохондрий объемом 0,04 мл до конечной концентрации белка в ячейке 0,8- 1,2 мг/мл. Через 1 мин после добавки митохондрий в полярографическую ячейку с помощью полуавтоматической микропипетки вносят 0,02 мл 100 мМ раствора АДФ. Автоматически записывают динамику изменения концентрации кислорода в ячейке. Убедившить, что зависимость изменения концентрации кислорода от времени линейна, через 1 мин после внесения АДФ с помощью микрошприца в ячейку вносят ингибитор АТФ-синтетазы олигомицин до конечной концентрации в ячейке 200 нг/мл, вызывающей полное ингибированиефосфо- рилирующего дыхания. После прекращения дыхания добавляют протонофорный разобщитель 2,4-ДНФ последовательно до конечных концентраций в ячейке 5; 10; 20; 40; 80 мкм. Управляющие коэффициенты окисления и фосфорилирования определяют по графику зависимости величины

Vs Р 1 гг от концентрации разобщителя

VP р и аналитическим методом по фомуле

Сф 1 - Сок. а

V3

V3

M- -SiPiS pi nStpf-CZMf

где УЗ - скорость фосфорилирующего дыхания;

Vp - скорость разобщенного дыхания;

концентрация разобщителя;

п - общее количество добавок разобщителя в процессе эксперимента;

Сок - управляющий коэффициент подсистемы окисления;

Сф - управляющий коэффициент подсистемы фосфорилирования.

Результаты определений приведены в табл. 1 и 2.

Пример 2. Изучение влияния ротено- на на управлящие коэффициенты подсистем окисления и фосфорилирования, Исследуют влияние ротенона (специфического ингибитора НАДН-дегидрогеназы) на величины управляющих коэффициентов подсистемы окисления и фосфорилирования. Процедуры выделения митохондрий из мозга крыс самцов, а также измерения потребления кислорода митохондриальной суспензией те же, что и в примере 1. В качестве субстрата дыхания используют 15 мМ глутамат + 5 мМ малат. Как и в случае примера 1, определяют скорость фосфорилирующего дыхания в присутствии избытка АДФ (2 мМ), затем добавляют ингибитор олигомицин в концентрации, вызывающей полное ингибирование фосфорилирующего дыхания, затем добавляют 2,4-ДНФ в по0 следовательно повышающихся концентрациях 5; 10; 20; 40; 80 мкм и определяют скорость дыхания при каждой концентрации разобщителе.

Составляют график, по оси ординат ко5 торого откладывают численное значение

Г 1 V3с.

выражения р - а по оси аосцис-концен- Vp

трацию разобщителя р и определяют управляющий коэффициент подсистемы 0 окисления как тангенс угла наклона экспериментальной прямой. Управляющий коэффициент подсистемы фосфорилирования определяют по формуле

Сф 1 - Сок

5Ротенон применяют в концентрации

35 нМ. вызывающей подавление скорости фосфорилирующего дыхания на 60%.

Тангенс угла наклона экспериментальной прямой в присутствии ротенона равен

0 0,91, а в отсутствии его 0,68. Следовательно, под влиянием ротенона управляющий коэффициент подсистемы окисления повышается с 0,68 до ,091. Следовательно управляющий коэффициент подсистемы

5 фосфорилирования снижается с 0,32 до 0,09. Таким образом, ротенон, ингибируя скорость фосфорилирующего дыхания на уровне подсистемы окисления, увеличивает ее управляющий коэффициент.

0 Формула изобретения

Способ определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования системы окислительного синтеза АТФ. включающий определение

5 скорости фосфорилирующего дыхания в присутствии высоких концентраций АДФ, добавление протонофорного разобщителя и определение скорости разобщенного дыхания, отличающийся тем, что, с целью

0 упрощения и повышения точности способа, до добавления разобщителя в инкубационную среду вводят ингибитор олигомицин в концентрации, вызывающей полное ингибирование фосфорилирующего дыхания,

5 разобщитель добавляют в последовательно повышающейся концентрации, скорость разобщенного дыхания определяют для каждой концентрации разобщителя и затем рассчитывают управляющие коэффициенты

подсистемы окисления Сок и фосфорилиро- вания Сф по формулам

V3

V3

W

Сок

nSlpf-dW)2

где п - общее количество добавок разобщителя в процессе эксперимента;

концентрация разобщителя;

УЗ - скорость фосфорилирующего дыхания;

Vp - скорость разобщенного дыхания, или по графику зависимости величины

Уз

от концентрации разобщителя р,

Vp

где управляющий коэффициент стемы окисления определяется как тангенс угла наклона экспериме гальной прямой.

Изобретение относится к биохимии и к биофизике и может быть применено при излучении in vitro регуляции окислительного фосфорилирования как энергетическими метаболитами, так и различными химическими и фармакологическими агентами. Целью предлагаемого изобретения является упрощение, повышение точности и расширение диапазона применения способа определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования за счет использования инкубационных сред с различной буферной емкостью. На фоне фосфорилирующего дыхания митохондрий в инкубационную среду добавляют ингибитор олигомицин в концентрации, вызывающей полное ингибирование дыхания, затем добавляют разобщитель в последовательно повышающихся концентрациях, скорость разобщенного дыхания опредепяют для каждой концентрации разобщителя, затем определяют управляющие коэффициенты подсистем окисления и фосфорилирования аналитически или графически. 2 табл. СО С

Т а б л и ц а 1

Таблица2