Способ отбора физиологически активных веществ, снижающих гиперактивность сукцинатдегидрогеназы Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к фармакологии и прелнпз начено для тестирования физиологически активных веществ, способных нормализовать окислительно-восстановительный обмен, и может быть использовано в фармакологии и в научных исследованиях, направленных на изучение регуляции знергетическо- го метаболизма.

Целью изобретения является разработка способа отбора физиологически активных веществ, ограничивающих гй- перактивность сункцинатдегидрогеназы.

По способу скрининга веществ путем измерения скорости дыхания митохондрий в присутствии и в отсут-- ствии тестируемого вещества согласно изобретению измерения проводят на митохондриях, выделенных из сердца голубя, в присутствии сукцината.

На фиг. 1-5 представлены диа- граммы скоростей дыхания митохондрий сердца голубя и митохондрий печени крысы.

Диаграммы (фиг. 1) представляют сравнение скоростей дыхания митохондрий сердца голубя, окисляющих сук- цинат (кривая 1) и НА,Ц-зависимый сзгб- страт глутамат (кривая 2) и митохондрий печени крысы, окисл5пощих сукцинат (кривая 3); стрелками обозначены моменты внесения веществ., стимулирующих дыхание митохондрий - аденозиндифосфата калия (АДФ) и .2,4-динитрофенола (ДНФ). Диаграммы (фиг. 2 - 5) представляют скорости дыхания митохондрий сердца голубя, окисляющих сукцинат (в том числе в присутствии АДФ и ДНФ), в контроле (кривые 1) и в присутствии тестирует мого вещества - обзидана. В концентрации 5 -Ю на 1 мг белка и митохондрий экстракта подорожника, добавляемого в количестве 0,02 мл на 1 мг белка, тиабендазола в концентрации на 1 мг белка и мебендазола в концентрации 5 на 1 мг белка митоз ондрий (кривые 5) , а также ско(Л

С71

00

i4:i СП

рости дыхания митохондрий печени крысы, ОКИСЛЯЮП5ИХ сукцинат в контроле (кривые 6) и н присутствии тех же самых тестируемых веществ (кривые 7)

Пример 1. Испытывали влияние веществ обзидана (пропранолола), применяемого при ишемических состояниях сердца, экстракта подорожника, широко яспользуемого противовоспалитель- кого средства, и антигельминтных препаратов тиабендазола и мебендазо- ла на скорости дыхания мит.охондрий сердца голубя и печени крысы.

Митохондрии сердца голубя вьще- ляли из двух сердец голубя (вместе) методом двойного центрифугирования. Для этого изолированные сердца погружают в охлажденную до 0°С среду выделения. Состав среды выделения: 0,32 М сахароза, 0,001 М ЭДТА, 30 мМ трис- НС1, рН 7,5. Ткань сердца мелко нарезали ножницами, продавливали через пресс с отверстиями 1 мм, полученную массу гомогенизировали в среде вьщеления, взятой в отношении к весу ткани сердца как 8:1, Все операции проводили в холодной комнате при 0-2 С охлажденными инструментами. Крупные фрагменты клеток и ядер осаждали при 600 g в течение 10 мин. Су- пернатант сливали и вновь центрифугировали при 12000-g 10 мин. Осадок после второго центрифугирования сус- пендировали в охлажденной среде сус- пендирования (0,32 М сахароза, 1 мМ трис-НС1, рН 7,5) из расчета 1 мл на 10 г сырой ткани сердца.

Митохондрии печени крысы выделялись по методу Н.Н.Кондрашовой, Е.А.Григоренко. Для этого продавленную через пресс ткань печени гомогенизировали в среде выделения, взятой в отношении к весу ткани печени 8 :1 .Первое центрифугирование проводили при 500 g 7 мин, затем сурернатант вновь центрифугировали при 4500 g 15 мин. Полученный осадок суспендировали в среде вьщеления (1 мл среды на 10 г исходного веса ткани печени). Все процедуры проводили при . , Концентрацию кислорода в процессе :дыхания измеряли полярографически с помощью платинового электрода в закрытой ячейке объемом 1 мл. Измерения проводили полярографом LP7 (ЧССР).

Среда инкубации митохондрий сердца голубя содержала 0,3 М сахарозу.

.

ic 20 25д

50

5

0,5 мМ ЭДТА, 3 мМ , 0,03 мМ трис-FICl, рН 7,5. Концентрация сукци- ната 5 Mli. Содержание митохондриаль- ного белка в ячейке 2 мг в 1 мл. Среда -инкубации для митохондрий пе- чени крысы содержала 0,15 М сахарозу 50 мМ КС1, 3 мМ , 5 мМ трис- НС1, рН 7,5. Концентрация сукцината 5 мМ. Содержание белка митохондрий 4 мг в 1 мл.

Пер.ед внесением митохондрий в ячейку для регистрации потребления кислорода регистрировали ток,соответствующий табличному содержанию кислорода в среде инкубации митохондрий сердца голубя или печени крысы при 25°С - 500 нг-ат. О в 1 мл.

Затем в ячейку вносили митохонд- рии в количестве, соответствующем указанному содержанию белка, и регистрировали изменение содержания 0 в процессе окисления сукцината.. По ходу процесса производили добавки АДФ до конечной концентрации 150 мкМ и ДНФ до конечной концентрации 20 мкМ для митохондрий сердца голубя и 50 мкМ для митохондрий печени крысы, вызывающие увеличение скоростей дыхания митохондрий (моменты внесения добавок обозначены стрелками). Скорости дыхания рассчитывали как производную содержания 0 в измерительной ячейке, т.е.-как количество кислорода, поглощенного за 1 мин на 1 мг белка митохондрий. Таким образом бьши получены данные для построения диаграмм скоростей дыхания митохондрий сердца голубя, окисляющих сукцинат (кривые 4) и митохондрий печени крысы, окисляющих сукцинат (кривые 6). Экспериментальные данные для построения диаграмм скоростей дыхания митохондрий сердца голубя и печени крысы, окисляюрщх сукцинат, в присутствии обзидана были получены аналогично за исключением того, что перед внесением митохондрий в измерительную ячейку вносили обзидан в

конечной концентрации (кривые 5 и 7 фиг. 2).

Как видно из этих кривых, обзидан в концентрации 5-10 на 1 мг белка митохондрий ингибирует дыхание митохондрий сердца голубя (кривая 5) в присутствии АДФ на 58 t 2%, а дыха- ;ние в присутствии ДНФ - на 73 ± 2,2% с достоверностью р 0,01 в серии из гаести опытов. Дыхание митохондрий пе

чеии крысы практически не ингибирует -ся ( кривые 6. и 7) обзиданом в указанной концентрации. По данным, полученным ранее, значительное увеличение кцентрации обзидана может вызвать и ингибирование окисления сук.цината ми тохондриям печени. Такая зависимост влияния на окисление субстратов от концентрации.характерна ппя многих веществ.

Следовательно, обзидан является вегцеством, ограничивающим гиперактивность суктщнатдегидрогеназы. Отсутствие его влияния на скорости дыхания митохондрий печени в указанной концентрации говорит о его нетоксичности .

Пример 2. В качестве другого исш- туемого вещества, брали экстракт подорожника, который готовили следующим образом. 10 г сухого листа помещали в термос, заливали кипяр ей водой (100 мл) и экстрагировали в течение 12ч. Полученный экстракт отфильтровывали. Для устранения ионов кальция, которые маскируют э )- фект ингибирования, экстракт обрабатывали смолор Дауэкс, при этом он значительно.обесцвечивался. Экстракт добавляли к суспензии митохондрий в количестве 0,02 мл на 1 мг белка митохондрий. С этим веществом повторяли все процедуры, описанные для обзидана. Л 1агра мы скоростей дыхания митохондрий сердца голубя и митохондрий печени крысы, окисляюрщх сукцинат в присутствии экстракта подорожника, представлены на Лиг. 3 (кривые 5 и 7)

Как видно из этих диаграмм, дыха-. ние митохондрий сердца голубя в присутствии АДФ ингибируется этим препаратом на 65,7 ± 1,2% (достоверность р 0,001 по критерию Вилкоксона в серии из 16 опытов). Дыхание митохондрий печени крысы в данной концентрации практически не ингибируется. Следовательно, экстракт листьев подорожника -является средством, ограни- чиваюршм гиперактивность сукцинат- . дегидрогеназы . Увеличение концентрации действующего начала экстракта подорожника в несколько раз вызывает ингибирование скорости окисления сукцината и митохондриями печени .крысы приблизительно на 30%, как это характерно для обзидана.

Пример 3. Процедура была повторена для тиабендазола и затем

10

15

20

25

н

.

.« 30

35

45

50

5

для мебендазола. Результаты этих исследований представлены на фиг. 4 и 5 соответственно. Как видно из сравнения кривых 4 и 5 (фиг. 4), дьгаание митохондрий- сердца голубя под действием тиабендазола в концентрации 10 И на 1 мг белка митохондрий в присутствии ДЦ ингибируется на 71 + 1,2%, а в присутствии ДНФ - на 73 + 1,5% с достоверностью р 0,01 по критерию Билкоксона в серии из шести опытов. Дыхание митохондрий прчени тормозится существенно меньше в присутствии той же концентрации тиабендазола (фиг. 4, кривые 6 и 7), Следовательно, этот препарат эффективно ограничивает гиперактивность сукцинатдегидрогеназы. Однако наличие ингибирующего влияния на м1- то хондрии печени говорит о токсичности тиабен.- дазола, что подтверждается клинической практикой.

П р и м е р 4. Исследовали мебенда- зоп, как описано. Мебецдазол оказывает ингибирующее влияние в более высокой концентрацт-ги. В присутствии мебендазола на 1 мг белка митохондрш (фиг. 5) дыхаш-ie митохондрий сердца голубя снижено на ± 3,6% в присутствии АДФ и на. 54 + 3,5% в присутствии ДНФ. Достоверность р 0,01 в серии из шести опытов по критерию Вилкоксона.. Следовательно это вещество также является ограничивающим гиперактивность сукцинатдегидрогеназы. При этом также ингибируются скорости дыхания мито- хондри.ч печени крысы, но в меньшей .сг епени.чем тиабендазолом, что говорит о его меньшей токсичности. Это согласуется с клиникой.

Таким образом, приведенные примеры показывают, что проверенные лекарственные вещества, применяемые при состояниях, сопровождаюпщхся гиперактивацией суцинатдегидрогеназы, ограничивают окисление сукцината в митохондриях сердца голубя, особенно IB присутствии АДФ и ДНФ. Влияние этих - веществ на скорости дыхания митохонд рий печени крысы выражено в значительно меньшей степени или вовсе на наблюдается. Следовательно, предлагаемый способ может быть использован для отбора веществ, ограничивающих патологическую гиперактивность cyKLiji- натдегидрогеназы.

Сраннение ноздейстния тиабендазо- ла и меГ) ендазола - веществ,относя1цихся к одному классу антигельминтных препаратов, показывает, что количественные оценки, получаемьге предлагаемым способом, согласуются с терапевтической активностью этих препаратов.

Практическое значение предлагаемого способа состоит в том, что он позволяет делать качественный отбор новмх веществ или расширять возможности использования уже имеющихся препаратов по новому чувствительному показателю - влиянию на активность сук1ц натдегидрогеназы, являющуюся важной характеристикой энергетического обмена. Способ позволяет охарак- .теризовать уже известные препараты и с этой точки зрения, что сделает более обоснованным назначение препаратов и уточнит механизм их действия.

Важно отметить, что вещества, отобранные таким способом, обладают именно ограничивающим действием на сукцинатдегидрогеназу, снижая гиперактивное окисление сукцината, но слабо влияя на окисление сукцината в норме, что может быть проверено на митохондриях печени крысы. Если препарат оказывает значительное влияние и на окисление сукцината митохонд

0

5

риями печени крысы, то это говорит- о его токсичности, как это показано в случае с тиабендазолом (фиг. 4).

Подобранные по показателю степени -ограничения гиперактивности сукцинатдегидрогёназы препараты должны найти, кроме известных показаний, широкое применение при профилактике острого стресса, при адаптации к работе в тяжелых условиях, при состояниях связанных с гипоксией и ишемией, особенно при выходе из этих состояний, при введении организма в состояние гипотермии и в ряде других случаев . 1

Формула изобрет

е н и я

Способ отбора физиологически активных веществ, снижающих гиперактивность сукцинатдегидрогёназы, вклю- чаюпщй измерение скорости потребления кислорода митохондриями сердца голубя в присутствии сукцината в условиях энергизации и деэнергизации митохондрий на фоне и в отсутствии тестируемого вещества и при уменьшении скорости потребления кислорода в присутствии тестируемого вещества,его относят к физиологически активным веществам, снижающим гиперактивность сукцинатдегидрогёназы.

Изобретение относится к фармакологии и позволяет эффективно отбирать новые лекарственные средства и характеризовать известные фармакологические препараты по новому важному показателю- ограничению гиперактивности сукцинатдегидрогеназы. По предлагаемому способу это свойство определяется по ингибированию дыхания митохондрий при окислении сукцината, причем с целью повышения чувствительности предлагается использовать митохондрии сердца голубя и проводить измерения в присутствии аденозидифосфата калия или 2,4-динитрофенола. 5 ил.

нг-ад.О мин мг Оелш

300

в

0,5 щн.мг белка.

200

160

120

во

40

0,5 юа-Ttr белка

нг-ат.О мкя-мг овлка в1

120

«

0,5 шга.мг б8дка

160

0.5 мжя-кг «exKf

Г- I

Ш