Способ криоконсервирования ткани Советский патент 1988 года по МПК A01N1/00 

со со оэ

00 СХ) N)

Изобретение относится к биологии и медихщне и может быть использовано при низкотемпературном консервирова-- НИИ тканей с целью последующей их трансдлантации.

Целью изобретения является повышение эффективности способа за счет сохранения функидональнык свойств ткани.10

Пример 1, Щитовидную железу быка разрезают на кусочки размером 2x4x12 мм (именно такой размер используется для последующей трансплан- тащ-ш реципиенту) и составляет из них образцы для исследований объемом ,5 см каждый.

Образцы помещают в пробирки, содержащие по 5 см 10%-ного водного раствора диметилсульфоксида(ДМСО)1 20 инкубируют различное время от 5 до 540 с при температуре +10 С.

После инкубации образцы последовательно помещают в рабочую ячейку устройства для теплофизических ис 25 следований и охлаждают от +10 до со скоростью 1,. В процессе охлаждения одновременно на независимых двухкоординатных графопостроителях записывают дилатограммы и ЗО термограммы охлаждаемых образцов, по которым определяют температуру Т ,р начала кристаллизации воды в тканях

образцов и максимальное увеличение

т макс

Объема , эт:ях тканей при кристаллизации.

На фиг; 1 и 2 приведены графики зависимостей величин Тцр и ,, от времени инкубации , полученных

путем измерения теплофизи ческих пара- .« метров образцов, инкубированных от

5 до 5-10 с.

Из приведенных кривых видно, что, как температура начгша кристаллизации Т , так и максимальное увеличение объема при кристалтшзации непрерывно уменьшаются по мере увеличения времени инкубации вплоть до значения мин.

Полученные заззисимости Т j, (tj, ) и 4 V )(t ц„1) отражают кинетику - О проникновения молекул криопротекто

ра в ткань и позволяют определить оптимальное время инк багщи. Это время определяется непосредственно по параметрам, отражающим защитное действие - криопротектора.

.. мпьгг „

на

35

Выход величин а 1 1 и ЙТ

Kf

кр

насыщение после некоторого времени

0

0

5 О

.«

О

5

инкубации означает окончание тех процессов изменения молекулярной структуры ткани под действием криопротектора, которые непосредственно влияют на характер кристаллизации воды в ней. Это позволяет повысить точность определения величин .Если например, за tg выбрать время, в течение которого взаимодействующий с тканью криопротектор успевает реализовать 90% своих защитных свойств, то, исходя из графиков (фиг.1 и 2) можно определить, что tpn-r 0- мин. Известный способ, определяющий концентрацию криопротектора лишь в растворе, не позволяет делать выводы

0кинетике его взаимодействия с тканью, что приводит к погрешностям при определении tonr в десятки минут. I

Результаты исследования способности щитовидной железы к аккумуляции радиоактивного йода после замораживания - оттаивания в зависимости от времени инкубации ее в 10%-ном растворе ДМСО приведены в табл. 1.

Представленные в табл. 1 данные показывают, что насыщение щитовидной железы 10%-ным ДМСО обеспечивает кри- озащитный эффект после 40 мин инкубации, который сохраняется и после 60 мин инкубации. Дальнейшая инкубация (120 мин) не приводит к повышению жизнеспособности, это говорит о том, что к 40-60-й мин произошло полное насьщение ткани.

1. Пример 2. Из фрагментов селезенки быка размером 2x4x12 мм подготавливают 12 образцов объемом

0,5 см каждый. Эти образцы помещают в пробирки, содержащие по 5 см 30%-ного водного раствора этиленгли- коля, и инкубируют при +10 С в течение различных отрезков времени от 5 до 5 МО 5 с. После инкубации их поочередно помещают в рабочую ячейку устройства для теплофизических исследований растворов и тканей и охлаждают от +10 до со скоростью 1,5°/мин, В процессе охлаждения образцов регистрируют их .объем как функцию температуры.

На основании полученных кривых строят график зависимости

(dV

moiKc

f(t кик) ,

де ЛУ

макс

У„ максимальное изменение объема образца при его кристаллизации; значение объемА образца при +10°С (т.е. 0,5 см).

Vo

Типичный вид зависимости (

aV

) ДЛЯ образцов, инкубируемых в 30%-ном водном растворе этиленгли - коля, показан на фиг. 3. Из графика следует, что оптимальное время инкубации образцов селезенки в данном случав составляет 9 10 t140 с (15,0± 2,3 мин).

Результаты исследования активности включения С-аминокислот в суммарные белки селезенки после замораживания - оттаивания в зависимости от времени инкубации ее в 30%-ном растворе этиленгликоля (ЭГ) приведены в табл. 2.

10

20

,-Л1«(КС ,

4 V 1 как функцию времеЭти образцы инкубируют раздельно в пробирках, содержащих по 10 см 30%-ного водного раствора ПЭО-ЗООО, которьй является непроникающим крио- протектором. После инкубации вновь замеряют объем образцов V| и снимают с них дилатограммы в процессе охлаждения от +10 до -80°С по указанной методике. Из полученных дилатограмм определяют ни инкубации.

Данные проведенных экспериментов приведены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что по мере увеличения времени инкубации фрагментов железы в 30%-ном водном растворе ПЭО-ЗООО их объем непрерывно уменьшается. Это демонстрирует эффективность дегидратации тканей в про- цессе инкубации. Вместе с тем по

мере увеличения t

МНК

уменьшается.

и объемный эффект при кристалпизации

Изобретение относится к биологии и медицине, предназначено для. низкотемпературного консервирования тканей с их последующей трансплантацией. Цель изобретения - повышение эффективности способа за счет сохранения функциональных свойств ткани. Для этого определяют оптимальное время инкубации ткани, для чего определяют температуру начала кристаллизации воды в ткани или максимальное увеличение объема ткани в процессе кристаллизации, строят графики зависимости первого или второго показателя от времени инкубации и по времени движения уровня насыщения определяют время инкубации ткани. Затем ткань инкубируют с криопротектором

Представленные данные показывают, что криозащитное действие 30%-ного раствора этиленгликоля проявляется только после 90 и 120 мин инкубации в них ткани селезенки. В этих условиях сохраняется 68-70% исследуемой активности, в то время как после 5-60 мин инкубации активность включения С-аминокислот не превышает 43%. Дальнейшая инкубация (180 мин) также не приводит к повышению жизнеспособности, что указывает на то, что уже к 90-120 мин инкубации происходит насыщение ткани селезенки этиленгликолем, необходимое для проявления ее криозащитного эффекта.

Способ также применим для определения времени инкубации тканей с не- проникакщими криопротекторами. ОсновСпособ криоконсервировання ткани, включающий инкубацию ткани с криопро- тектором с предварительным определением оптимального времени инкубации и последующим охлаждением, о т л и-

нее действие последних состоит в дегидратации инкубируемых в них тканей. 45 чающийся тем, что, с целью Потеря тканью слабо связанной водыповьшения эффективности способа за

также приводит к заметному уменьше-счет сохранения функциональных свойств

нию объемного эффекта при ее кристаллизации,

50

что позволяет и в этом слу- опт

чае определять по кривым

Пример 3. Щитовидную железу быка разрезают на фрагменты размером 2x4x12 мм и составляют из них образцы для исследований объемом V я 1 см каждый.

5В

ткани, определяют температуру начала кристаллизации воды в ткани или максимальное увеличение объема ткани в процессе кристаллизации, строят графики зависимости первого или второго показателя от времени инкубации и по времени достижения уровня насыщения определяют оптимальное время инкубации.

25 ткани: от 11,5% при t. 0 до 3,9%

0

5

0

при t

UHK

600 мин, выходя после

600 мин инкубации практически на на- сьпцение. Исходя из полученных данных определяют t° . Принимая за

опт CUHK время, при котором реализуется

90% защитного эффекта, имеют . 100 мин ± 2,0 мин.

Этот результат достаточно хорошо , подтверждается данными по исследованию способности щитовидной железы к аккумуляции радиоактивного йода.

Формула изобретения

Способ криоконсервировання ткани, включающий инкубацию ткани с криопро- тектором с предварительным определением оптимального времени инкубации и последующим охлаждением, о т л и-

5 чающийся тем, что, с целью повьшения эффективности способа за

50

5В

ткани, определяют температуру начала кристаллизации воды в ткани или максимальное увеличение объема ткани в процессе кристаллизации, строят графики зависимости первого или второго показателя от времени инкубации и по времени достижения уровня насыщения определяют оптимальное время инкубации.

Условия эксперимента Включение к контролю,%

Интактная щитовидная железа (контроль)

Инкубация с 0,9% NaCl Инкубация с ДМСО,мин:5

Условия эксперимента

лезенка

0,29410,04

0,9% NaClО,108±0,06

ЭГ, мин: 30,094±0,01

300,12810, 03

450,14410,02

600,11910,02

900,18910,03

1200,211±0,04

1800,196tO,07

ТаблицаЗ

100

97

86

70

58

Таблица 1

0,1б9± 0,011

0,07810,006 0,,009

150,099±0,008

400,141+0,014

600,171±0,015

1200,l68tO,015

Таблица 2

Включение С-аминокислот к контролю,%

0,74±0,02

0,3110,01

0,06810,01

0,04910,02

0,05110,01 .

I

I

. -2 1

I - I

.

ч

I I

/2

Ю

,

JO/0 fO .опт Ю

инк Время инкубации Jf;,;.,

Фие,2

ю%дмсо

i -L

onr Ю

инк

10

ЮУоДМСО

L

Ю

S

j.onT

KHK

70 70SpeMff инкубации t, с Фиг.

307o ЗГ

j.onT

KHK

, с