@ -Оксиэтил-гепта(оксиэтилен)-морфолин в качестве криопротектора Советский патент 1984 года по МПК C07D295/08 A01N1/02 

эо

со Изобретение относится к химическом соединению, конкретно к N-оксиэтилгепта(оксиэтилен)-морфолину формулы (oia-CHto)7 сн,сн,о ( используемому в качестве криопротектора, и может найти применение при низкотемпературном консервировании ядро содержащих клеток, в частности клеточных культур, выделенных из раз личных органов животных. Наиболее близким по структуре к соединению формулы (j) является N-OK сиэтилморфолин формулы ,sCHjCHjOHv который используют для изучения кин тики оксиэтилирования аминов l Известен диметилсульфоксид (ДМСО используемьй в качестве криопротектора при низкотемпературном консервировании биологических объектов, в частности, культур клеток . Однако ДМСО наряду с защитными свойствами (предупреждающими или ос лабляющими повреждающее действие замораживания и оттаивания на клето ные культуры при их низкотемператур ном консервировании) может оказыват токсическое действие на биологические объекты. В случае проникновения его внутрь клетки возникает осмотический градиент на границе клетка околоклеточная среда, который при переносе клетки в изоосмотические условия может оказаться причиной ги бели живых структур. Для предупрежд ния указанного повреждакщего действи приходится удалять криопротектор из клеток перед переводом их в физиоло гическую осмотическую среду. .Удаление криопротектора из клеток усложняет и удорожает весь процесс криоконсервирования. Таким образом, ДМСО требует отмывания клеток после размораживания, чтоусложняет процесс консервирования, поскольку при отмывании необходимо соблюдать строгую асептику, и делает его дорогостоящим (применение специальных сред, занятость дополнительного, персонала). Он не экономичен, поскольку применяется в относительно высоких концентрациях (до 10%). Формирование монослоя кле10 2 точных культур, Чюдвергавшихся-замораживанию под его защитой, происходит только на 4-5 сут. Он неустойчив при хранении: разлагается с образованием серосодержащих продуктов, обладающихорезким неприятным запахом (cpoij хранения до 1 мес.). Цель изобретения - упрощение и удешевление процесса криоконсервирования, а также повышение степени защиты биологических культур при низкотемпературном консервировании. Поставленная цель достигается тем, что в качестве криопротектора приме„яют соединение формулы (l). Соединение формулы (1) получают взаимодействием морфолина с окисью этилена при 90-100с в атмосфере азота и давлении 800-1000 кПа. . 85г(1 моль) свежеперегнанного морфолина помещают в обогреваемый реактор из нержавеющей стали, снабженный электромешалкой, термопарой и устройством для дискретной подачи окиси этилена и системой охлаждения, и нагревают до 60-80°С. В реакционную смесь медленно порциями по 5-10 мл подают 4-40 г (8 моль) окиси этилена, регулируя давление в пределах 800-1000 кПа. Реакцию проводят в атмосфере азота, не допуская повьпиения температуры вьш1е 90-100 С. Реакционную смесь после подачи .всей окиси этилена выдерживают 1-1,5 ч при 70-75°С, периодически продувая реактор азотом. Очитку полученной темноокрашенной жидкости (420 г) производят путем многократной (3-5 раз) обработки разбавленного 3-4 раза водного раствора активированным углем марки А, катионообменной смолой Ку-2-8с. Воду и невошёдший в реакцию исходный морфолин от синтезированного соединения отделяют, отгоняя их в вакууме (0,45 кПа, 27-3lc). Выход соединения (J) 380 г (90%). Продукт синтеза подвергают дальнейшему вакуумному фракционированию, отделяя низкомолекулярные олигомеры 0,А-0,5 кПа, 100-150°С). Выход соединения формулы (I) 320 г (77%). Строение полученного соединения подтверждается данными элементного анализа, определения молекулярной массы и ИК-спектроскопии. Найдено,%: С 55,01; Н 9,72-; N 3,08. Вычислено, %: С 54,66; Н 9,33; N 3,19. Молекулярная масса расчетная 436, экспериментальная А25. ИК-спектры сняты на спектрофотометре Spekord-75 в кюветах CaFj. Толщина слоя 0,8 мм, растворитель , остаточное содержание влаги в образце не превышает О,1%, При сравнении ИК-спектров получен ного соединения и исходного морфолин оказалось, что наиболее сильные разл чия наблюдаются в области поглощения валентных колебаний амино- и оксигрупп (3600-3200 см). Если в спектре исходного соединения поглощение с макс мумом средней интенсивности появляется полоса поглощения при 3320 см , относящаяся к валентным колебаниям аминогруппы, то в спектре оксиэтилированн го производного вместо нее появляетс широкая сложная полоса поглощения при ЗАОО-3595 см , обусловленная ва лентными колебаниями ассоциированных гидроксильных групп полиоксиэтиленовой цепи.j Отсутствие полосы, обусловленной колебаниями аминогруппы в ИК-спектре полученного соединения, свидетельствует об отсутствии в целевом проду те непрореагировавшего исходного сое динения. Полосы поглощения валентных и деформационных колебаний CHj-rpynn в области 3000-2800 и 1400-1200 см отражают характер поглощения колебаний полиоксиэтиленовой цепи. Исследование криопротекторных свойств.соединения формулы (I) прово дят следующим образом. Суспензию клеток почки эмбриона свиньи в рсенизированную (СПЭВ) 242 пассажа и :криопротектор , N-оксиэтилгепта(оксиэтилен) -морфолин охлаж дают в холодильнике до 4°С, после чего к суспензии при осторожном перемешивании в соотношении 1:1 добавляют раствор криопротектора, приготовленный на среде 199 с рН 7,4 Концентрация клеток (конечная) в суспензии 8 млн в 1 мл. Клетки выращивают в монослое на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота иПО 100 ед. пенициллина натриевой соли и стрептомицина хлоркальциевого комплекса на 1 мл питательной среды. Выбор оптимальной концентрации криопротектора и режима охлаждения клеток осуществляют в условиях многофакторного эксперимента при разных концентрациях криопротектора от 1,5 до 15% (конечная концентрация) и скоростях охлаждения.- Наилучшие результаты получают при использоваНИИ криопротектора в 4,5-5,5%-ной концентрации. При более низких и при более высоких (15%) концентрациях формирование монослоя значительно (в 2-3 раза) запаздывает по сравнению с контролем (нативный материал). При этом монослой выполняют отдельными островками, в ряде случаев-сливающимися, его рисунок сглажен. Требуется проводить замену питательной среды (1-3 раза) или пересев клеток. Таким образом, Отклонение концентрации криопротектора от оптимума приводит к тому, что время форг рования монослоя в 2-3 раза превьш1ает время его выполнения при оптимальной концентрации. Суспензию клеток, смешанную с криопротектором, инкубируют при Д С в течение 15 мин,, затем разливают в стеклянные ампулы по 2 мл, которые после запаивания помещают в контейнеры. Весь период эквилибрации клеток в среде криопротектора составляет 40 мин. Замораживание суспензии ведут по двухэтапной программе: со скоростью . мин до затем 1и С/мин до -196 С. Оттаивание проводят в водяной бане при 41 С. После оттаивания жизнеспособность клеток оценивают по результатам прижизненной окраски трипановым синим (86%). По морфологическим признакам клетки СПЭВ сохраняют в монослое эпителиоподобную форму, имеют вид неправильного четырехугольника. Цитоплазма клеток гомогенная, немного мелкозернистая. Ядра клеток округлой формы, реже овальной с 2-5 ядрьпиками. Митотическая активность размороженных клеток не отличается от клеток, не подвергшихся: замораживанию (контроль).,В первые сутки роста после размораживания в культуральной среде на матрасах митотическая активность составляет 33,3+1,5%, на вторые сутки 39,0+6,1% и на третьи

J10890906

43,Oil,5%. Монослой деконсервирован- дования криопротекторных свойств соеных и контрольных клеток формируется динения формулы (1) представлены на третьи сутки роста. Результаты исслё-- в таблице,

Сравнение криозащитных свойств соединения формулы (1) и ДМСО

Н-Оксиэтилгепта(оксиэтилен)-морфол ин формулы / / Л (СН2-СН20)7 - CHj CHjO в качестве криопротектора.

Конечная концентрация криопротектора, %

Отмывание размороженных клеток с двукратным центрифугированием

Жизнеспособность, %

Рост клеток в монослое, сут

Срок хранения Соединение формулы (1) в качестве криопротектора обеспечивает криозащи ту при концентрации 4,5-5,5%, что в 2раза меньше необходимой для этих целей концентрации ДМСО. Формирование монослоя клеток культуры СПЭВ после консервирования с соединением формулы (1) происходит в течение 3сут (аналогично контролю) ,что уменьшает расход питательных сред. Соединение формулы (I) в качестве криопро тектора не требует отмывания, что упрощает и удешевляет процесс консер вирования, и устойчиво при хр|1Нении (до 2 лет)..

4,5-5,5

Не требуется .8.6

3 2 г Таким образом, N-оксиэтилгепта (оксиэтилен)-морфолин может эффективно использоваться в качестве криопротектора при замораживании клеточных культур. Предпагаемьй криопротекТор экономичен, поскольку применяется в относительно низкой концентрации, не обладает токсичностью для клетокj в результате чего исключает удаление его из клеток путем многократного отмывания, не снижает пролиферативную активность деконсервированных клеток, что значительно повышает производительность труда.