Способ определения активированных нейтрофильных лейкоцитов Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

со со

1чЭ

00

10

15

20

25

Изобретение относится к гемоцито- логии и может быть использовано в гематологии, иммунологии, хирургии,терапии, педиатрии, фтизиатрии, при ин- фекционной патологии для оценки функционально-метаболическоРо состояния нейтрофильных лейкоцитов с целью диагностики бактериальных инфекций. Целью изобретения является повышение точности способа.

Сущностью изобретения, является возбуждение люминесценции в цитоплазме активированного нейтрофиль- ного лейкоцита монохроматическим излучением видимой части спектра с длиной волны 460-490 нм с последующим измерением интенсивности люминесценции активированных нейтрофилов (ИЛАН) фотоэлектрическим или другим объективным методом,

Предлагаемьш способ основан на открытом явлении: после инкубации с нитросиним тетразолием (НСТ) в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов при облучении Их монохроматическим светом с длиной волны 460-490 нм возникает интенсивная собственная люминесценция, не связанная с содержащимся в клетках формазаном. Люминес- цируют только нейтрофилы, составляющие НСТ в формазан. Способностью восстанавливать НСТ обладают активированные стимулирующими факторами нейтрофилы. Клетки, не восстанавливающие НСТ, не люминесцируют. Это позволяет считать доказанным, что люминесценция возникает именно в активированных нейтрофильных лейкоцитах. Свечение выявляемся в нейтрофилах, содержащих в цитоплазме не только глыбки и крупные гранулы формазана, но и мельчайшую пылевидную зернистость, которая в известном способе вовсе не учитьшается. Отложения формазана в цитоплазме нейтрофилов сами по себе не светятся; люминесценция локализуется в участках цитоплазмы, свободных от формазана. Таким образом, в предлагаемом способе критерием степени активации нейтрофильных лей- 50 коцитов является интенсивность люминесценции клетки, а не количество формазана в ней.

Для возбуждения Л оминесценции в качестве источника света можно применять как ртутную лампу сверхвысокого давления ДРШ 250-3, так и галогенную лампу КГМ-9-70, обладающую не30

35

40

45

55

0

5

0

5

0

0

5

0

5

5

прерывным спектром. ИЛАН несколько возрастает при изменении длины волны возбуждающего света от 460 до 490 нм (табл. 1).

П р и м е РО Берут каплю крови из пальца больного С, Диагноз - ожоговая болезнь, осложнившаяся сепсисом. Каплю наносят на предметное стекло, до- бавляют 1 каплю гепарина (10 ед. в 1 мл физиологического раствора), смешивают с 1 каплей 0,1%-ного раствора нитросинего тетразолия в дистиллированной воде, рН 7,0. Проводят инкубацию в термостате 15 мин при , затем 15 мин при . Удаляют излишек инкубационной смеси, высушивают препарат на воздухе.

Для измерения ИЛАН помещают препарат на предметньй столик микроскопа - цитофлуорнметра Люман-ИЗ с фотометрической люминесцентной насадкой ФМЭЛ-1. Освещают препарат сверху через опакиллюминатор и объектив по методу светлого поля. Устанавливают возбуждающий интерференционный светофильтр с максимумом пропускания 470 нм и полушириной полосы пропускания 8 нм. Устанавливают запирающий оранжевьй светофильтр с полосой пропускания 520-700 нм. Наносят на препарат каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла, наводят люминесцентный объектив, апертура 1,25. Цитофлуориметром измеряют интенсивность люминесценции 50 нейтрофильных лейкоцитов.. Регистрацию анодного тока фотоэлектронного умножителя ФЭУ-79 осуществляют цифровым измерительным комплексом Р 385 К, в состав которого входит вольтфарадоомметр Р 385. Результаты измерений через транскриптор Ф 5033 и блок связи Р 385 К фиксируют цифропечатающей машиной ЭУМ- 23Д. Полученные индивидуальные значения интенсивности люминесценции 50 активированных нейтрофилов складывают, делят на 50, получают в пересчете на одну клетку значение ИЛАН 3,08 отНо ед., что диагностирует наличие септического процесса (бактериальной патологии), так как ИЛАН более 3,0 ед.

Проведены измерения 1штенсивности максимума в спектре люминесценции активированных нейтрофилов при различной полосе пропускания запирающего светофильтра ,

Результаты представлены в табл.1.

т а б

1394128 л и д а 1

но сравнению с известным

2 обоснована оптимальность длины волны возбуждающего

Таблица 2

Изобретение относится к гемоци- тологии. После инкубации с нитросиним тетраэолием в цитоплазме нейтро- фильных лейкоцитов смесь облучают монохроматическим светом видимой части спектра с длиной волны 460-490 нм, далее удаляют возбуждающее излучение оранжевым светофильтром с пропусканием в области 520-700 нм и по наличию люминесценции клеток определяют активированные нейтрофильные лейкоциты. Способ позволяет повысить точность определения в среднем в 4,8 ра- за, ошибка в среднем составляет 2,5%. 2 табл.

Л

вози

длина волны воз- буждсцощего излучения.

Как видно из табл. 1, полоса пропускания запирающего светофильтра 520-700 нм является его оптимальным параметром как при длине волны возбуждающего излучения 460 нм, так и ПРИ 490 нм.

Точность диагностики лабораторного теста характеризуется количеством истинных (т.е. соответствующих состоянию обследуемых пациентов) результатов, а также диагностической эффективностью теста случайных ошибок измерений.

Предпринято измерение 1ШАЛ в сравнении с визуальной оценкой НСТ-теста

в четырех мазках крови (двух здоро- 35 от возбуждающего излучения, которое

попадает в поле зрения микроскопа, подобран запирающий светофильтр с параметрами пропускания 520-700 нм, который пропускает в. глаз наблюдателя или на фотокатод ФЭУ только люминесценцию (максимум на 530 нм) и полностью отсекает возбуждающий свет (максимум на 490 нм). Таким образом, максимальный параметр длины волны

вых людей и двух больных сепсисом) опытными микроскопистами слепым методом в числе других препаратов. В каждом мазке измерение ИЛАН и подсчет НСТ-теста произведены по 20 раз повторно. Каждый раз измерению или подсчету в пределах мазка подвергали 100 нейтрофильных лейкоцитов.

При визуальном подсчете ошибка ме40

тода (коэффициент вариации) колеблет- возбуждающего излучения ограничен ся от 9,4 до 14,3%, составляя в сред- . минимальным параметром пропускания нем 12,1%. Особенно высока ошибка при подсчете клеток у больных, что объясбуждающим светом последний вносит ис- 50 кажение в свечение люминесценции.

Аналогичным образом параметры са запирающего фильтра. При нарушении границы запирающего фильтра возняется цитологической картиной в этих мазках и связанными с ней субъективными сложностями типирования нейтро- филов. При измерении ИЛАН ошибка колеблется от 2,0 до 2,9%, в среднем составляя 2,5%. В мазках здоровых и больных людей ошибка сходна. Таким образом предлагаемый способ позволяет повысить точность определения активированных нейтрофилов в среднем

мого запирающего светофильтра взаимосвязаны со спектром люминесценции (максимум 530 нм, правое крыло, 55 плавно спускаясь, доходит до 700 нм, левое -круто, спадает к 500 нм). Таким образом, оптимальность параметров запирающего светофильтра опредепя

Длина волны возбуждающего излучения, нм

Интенсивность мак- в спектре люминесценции, %

20

При длине волны возбуждающего излучения менее 400 нм люминесценция 25 практически неразличима глазом. Как видно из табл. 2, наибольшая интенсивность люминесценции наблюдается при длине волны возбуждающего света . 460-490 нм. При длине волны 490 нм люминесценция в 2,4 раза интенсивнее, чем при 400 нм. Дальнейшее увеличение длины волны возбуждающего света (более 490 нм) принципиально неприемлемо по следующим соображениям.

Для отделения света люминесценции

30

40

возбуждающего излучения ограничен минимальным параметром пропускания

запирающего фильтра. При нарушении границы запирающего фильтра возмого запирающего светофильтра взаимосвязаны со спектром люминесценции (максимум 530 нм, правое крыло, 55 плавно спускаясь, доходит до 700 нм, левое -круто, спадает к 500 нм). Таким образом, оптимальность параметров запирающего светофильтра опредепяется задачей наиболее полного сохранения света люминесценции при максимальном удалении возбуждающего излучения. Нижний параметр (500 нм) определяет разделение возбуждающего света и люминесценции, верхний (700 нм) ограничен переходом видимой части спектра в инфракрасную область.

Формула изобретения

Способ определения активированных нейтрофильных лейкоцитов, включающий

инкубацию гепариниэированной крови с раствором нитросинего тетразолия на предметном стекле, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, после инкубации смесь облучают монохроматическим светом видимой части спектра с длиной волны 460-490 нм, далее удаляют .возбуждающее излучение оранжевым светофильтром с пропусканием в области 520-700 нм и по наличию люминесценции клеток определяют активированные нейтрофильные лейкоциты.