СПОСОБ ОЦЕНКИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИСКУССТВЕННОГО СВЕТА НА ФУНКЦИИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/48 

Способ оценки воздействия искусственного света, генерируемого различными источниками, лампами накаливания, люминесцентными лампами, светодиодами, на функции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови относится к медицине, в частности к исследованиям нейтрофилов крови при действии факторов различной природы, и может быть использован для оценки влияния света, генерируемого искусственными источниками освещения, на клеточные факторы врожденного иммунитета.

В настоящее время для оценки влияния света, генерируемого искусственными источниками, используется анализ функций зрительного анализатора, который позволяет не только диагностировать патофизиологические процессы органа зрения, но и предложить решение гигиенических проблем, связанных с использованием осветительных приборов [Гусельников М.Э., 2008; Кучма В.Р. и соавт, 2013]. С обнаружением нового типа фоторецепторов в глазу и фотоакцепторов у нейтрофилов появилось понимание невизуального биологического влияния света на организм [Махмутхджаев А.Ш., 1999; Брейнард Г.К. и соавт, 2008]. При попадании света в клетки, имеющие специфические рецепторы, начинается сложная химическая реакция (с участием фотопигмента меланопсина) с продуцированием электрических импульсов. Эти клетки имеют тесные связи с двумя образованиями в мозгу: супрахиазматическими клетками (SCN) и с эпифизом, регулирующим секрецию определенных гормонов в организме [Brainard G.C. et al., 2002]. В сетчатке глаза световые волны определенной длины волны превращаются в энергию нервного импульса, которая передается по зрительному нерву в верхнюю часть спинного и в затылочную долю головного мозга, влияя на основные центры управления организмом, расположенные в головном мозге, в том числе на деятельность врожденных иммунных механизмов регуляции, осуществляемых нейтрофилами. Индивидуальная особенность нейтрофилов - наличие фоторецепторов, позволяющих данному типу клеток индивидуально реагировать на квант света [Долгушин И.И., 2001; Гизингер О.А. и соавт, 2013].

Способ оценки биологических эффектов действия искусственных источников света по изучению показателей зрительного анализатора имеет важное значение для определения риска возникновения как патологии органа зрения, так и системных патологических процессов [Биске К. и соавт., 2008; Зак П.П., 2012]. Однако используемый в качестве монометодики такой способ оценки действия света имеет определенные недостатки. В частности, использование человека как объекта исследования, дискомфорт, создаваемый для обследуемых при проведении эксперимента и приводящий к субъективной оценке результатов при проведении исследований in vivo, особенности нервно-психического статуса испытуемых на момент проведения исследования приводит снижению валидности получаемых результатов. Используется также биохимическая оценка влияния света, генерируемая различными искусственными носителями, в том числе и светодиодными, позволяющая выявлять возможные эндокринные нарушения [Анисимов В.Н., 2008] Однако чувствительность и специфичность такого метода не может быть очень высокой из-за вариабельности биохимических показателей, отсутствия строгих критериев включения и исключения испытуемых из обследования, высокой стоимости химических реактивов, человеческих трудозатрат.

В качестве одного из методов изучения действия искусственного света предлагается проведение анализа умственной работоспособности и утомляемости, свето- и цветовосприятия с применением методов психологического тестирования. При этом психологическое тестирование может установить лишь нервно-психическое состояние обследуемых, не затрагивая других физиологических показателей, и также не лишено субъективных подходов [Кришталь В.С., 2005]. Вместе с тем, значения отдельно взятых параметров, полученных по результатам тестирования, анкетирования либо комплекса тестирование + анкетирование не всегда отражают истинного состояния влияния света на все органы и системы человека, что связано с многообразием сопровождающих системные дисфункции нарушений [Долгушин И.И., 2001].

Известны литературные данные о прогнозировании риска возникновения патологии сердечно-сосудистой системы при действии освещения, генерируемого искусственными источниками освещения по оценке степени вариабельности сердечного ритма и анализе вегетативного показателя ритма сердца [Кудряшов Е.А., 2008]. Данный способ используется в медицине, но имеет ограниченное применение, вследствие сложного дорогостоящего оборудования, применяемого в данной методике.

Существуют методы, позволяющие при помощи анкетирования оценить влияние света на психосоматическое состояние обследуемых, однако при их использовании также не исключено влияние субъективных эндогенных и экзогенных факторов, влияющих на результаты исследования [Кучма В.Р., 2013]. Поскольку значения, полученные при данных методах исследований, могут быть ошибочными, например при проведении анкетирования или анализе биохимических показателей крови, то наиболее точным отражением выраженности действия света, генерируемого светодиодными носителями, может стать изучение действия света на модели клеток, имеющих фоторецепторы для квантов света [Клебанов Г.И., 1999; Козель А.И., 2000; Каш, T.I, 1987].

Известен способ «Оценки эффективности дезинтоксикационной терапии при воздействии токсинов различной природы» [Заявка №2334989 RU. МПК G01N 33/68. Способ; опубл. 27.09.2008]. Данный способ применяется в медицине, в частности при исследованиях нейтрофилов крови при действии токсинов различной природы, но имеет ограниченное применение, вследствие трудностей изучения ферментных систем нейтрофилов in vivo, дороговизны трудозатрат при проведении методики и невозможности его широкого использования в лабораториях. Поскольку других подобных методов оценки влияния экзогенных факторов на нейтрофильные гранулоциты нами найдено не было, то данный способ взят за прототип.

В основу изобретения положена задача, заключающаяся в создании экспериментальной модели, дающей возможность статистически грамотно оценить действие света, генерируемого светодиодными или иными искусственными источниками на нейтрофильные гранулоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров.

Указанная задача решается за счет того, что в нашем способе биологическая оценка действия света, генерируемого светодиодными или иными искусственными источниками света, происходит в более короткие сроки с полноценным клиническим и функциональным результатом, исключая прямое участие человека как модели для проведения эксперимента. Применение способа не требует дорогостоящей аппаратуры, дефицитных химических реактивов, доступно в практике санитарно-гигиенических служб, особенно важно при оценке биобезопасности новых, внедряемых в цветосветовую среду светодиодных источников, расширяет информацию о биологических эффектах света оптического диапазона.

Заявляемый способ позволяет объективно оценивать действия физических факторов на организм человека при использовании моделей клеточных культур нейтрофильных гранулоцитов. Ранее с помощью анализа клеточных культур проводилась оценка влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на нейтрофилы периферической крови доноров и секретов урогенитального тракта в условиях эксперимента [Гизингер О.А. и соавт, 2009].

Однако мы впервые предлагаем использовать данный метод изучения биологических эффектов влияния света, генерируемого светодиодными и иными искусственными источниками.

Для решения вышеуказанной задачи была исследована функциональная активность нейтрофилов клинически здоровых людей - добровольцев в возрасте от 18 до 22 лет. Для выделения нейтрофилов кровь забирали из локтевой вены в объеме 10 мл с антикоагулянтом гепарином в количестве 50 ед./мл. Для выделения чистой фракции нейтрофилов 2 мл крови смешивали с 3 мл стерильного физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлористого), наслаивали на градиент плотности стерильных растворов фиколла («Pharmacia», Швеция) и верографина («Spofa», Чехия), плотность верхнего слоя 1,075-1,077 г/см³, нижнего - 1,093-1,095 г/см³ и центрифугировали 40 мин при 1500 оборотах в минуту. Кольцо нейтрофилов собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, отмывали от градиента стерильным раствором Хенкса путем центрифугирования при 1500 оборотах в минуту дважды по 7 минут, после чего доводили до концентрации 5×10⁶ клеток/мл случайным образом делили на 4 группы, на которые в течение 10, 20 и 30 мин при температуре 37°C в диапазоне длин волн 320-400 нм, цветовой температуре 4000-4500 К при интенсивности действия светового потока 0,03 Вт/м² воздействовали различными искусственными источниками света: группа 1 (контрольная) - пробы находились при естественном освещении; группа 2 - на пробы воздействовали светом, генерируемым лампами накаливания; группа 3 - на пробы воздействовали светом, генерируемым люминесцентными лампами; группа 4 - на пробы воздействовали светом, генерируемым светодиодами. Опытные и контрольные пробы, содержащие суспензию нейтрофилов, во время облучения находились в специально оборудованных для проведения эксперимента термостатах. Световое поле было конфигурировано таким образом, чтобы в любой точке суспензии нейтрофилов отклонение плотности светового потока составляло не более 10% от заданных параметров излучения. Полученные результаты были подвергнуты статистической с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки. О достоверности различий средних величин судили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали значимыми при р≤0,05.

Качественный анализ показал, что десятиминутное воздействие света, генерируемого как светодиодными, источниками так и лампами накаливания на взвесь нейтрофильных гранулоцитов, не привело к достоверным изменениям их лизосомальной и фагоцитарной активности, кислородзависимого метаболизма, функционального резерва (р>0,05). НСТ-редуцирующая активность нейтрофилов в спонтанном режиме возрастала после воздействия света люминисцентных ламп по сравнению с естественным и светодиодным освещением (р=0,05). Результаты влияния различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro представлены в таблице 1.

Таблица 1 Влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro (время экспозиции 10 минут), (М±m) Показатели функциональной активности нейтрофилов Действие на нейтрофилы естественного освещения Действие на нейтрофилы светом, генерируемым лампами накаливания Действие на нейтрофилы светом, генерируемым люминесцентными лампами Действие на нейтрофилы светом, генерируемым светодиодами люминесценция лизосом, у.е 305,81±14,1 302,91±14,31 306,81±13,92 304,91±14,7 активность лизосом, % 93,79±1,22 94,72±1,22 94,71±1,22 95,79±1,19 НСТ-спонтанный, % клеток 36,59±1,51 35,59±1,51 37,05±1,51 37,09±1,51 НСТ-спонтанный, у.е./клетку 0,41±0,05 0,45±0,03 0,47±0,03 0,47±0,03 НСТ-индуциров., % клеток 60,24±1,41 63,66±1,62 67,47±1,54*† 60,67±1,47 НСТ-индуциров., у.е./клетку 0,69±0,03 0,74±0,033 0,76±0,032 0,81±0,030 функциональный резерв. нейтрофилов 2,33±0,13 2,54±0,14 2,61±0,13 2,66±0,13 активность фагоцитоза, % клеток 57,13±1,50 60,49±1,60 62,21±1,57 64,01±1,34 интенсивность фагоцитоза, у.е./клетку 1,81±0,12 1,83±0,17 1,84±0,12 1,84±0,09 Примечание: * - различие по показателям функциональной активности находящихся при естественном освещении и облученных искусственным светом нейтрофилов in vitro недостоверно, р≥0,05; † - различие по показателям функциональной активности нейтрофилов in vitro между группами при воздействии света, генерируемого лампами накаливания и генерируемого светодиодами, недостоверно, р>0,05.

Анализ данных, полученных после изучения лизосомальной, фагоцитарной активности и биоцидных возможностей нейтрофилов в НСТ-тесте, функционального резерва нейтрофильных гранулоцитов после 20-минутного воздействия также выявил различия в показателях лизосомальной и фагоцитарной активности, освещенных естественным светом, лампами накаливания и светодиодными источниками (р>0,05). После воздействия света люминисцентных ламп резко увеличивалось количество активных клеток в спонтанном НСТ-тесте (р=0,05) по сравнению с естественным освещением и освещением светом, генерируемым светодиодами, усиливался их фагоцитоз и секреторная активность. Полученные результаты свидетельствуют о выраженном иммуностимулирующем влиянии света, генерируемого люминесцентными лампами, тогда как лампы накаливания и светодиодные носители генерируют свет, не вызывающий выраженных иммунологических изменений нейтрофильных гранулоцитов. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro (время экспозиции 20 минут), (М±m) Показатели функциональной активности нейтрофилов Действие на нейтрофилы естественного освещения Действие на нейтрофилы светом, генерируемым лампами накаливания Действие на нейтрофилы светом, генерируемым люминесцентными лампами Действие на нейтрофилы светом, генерируемым светодиодами люминесценция лизосом, у.е 285,81±15,19 281,91±12,00 387,81±12,92* 299,91±11,71** активность лизосом, % 83,22±1,22 84,77±1,00 94,91±0,22* 85,69±1,09** НСТ-спонтанный, % клеток 26,49±1,51 25,00±1,33 45,05±1,22* 26,09±1,09** НСТ-спонтанный, у.е./клетку 0,37±0,05 0,41±0,034 0,59±0,03* 0,40±0,026** НСТ-индуциров., % клеток 60,00±1,56 61,22±1,22 71,47±1,00* 61,67±1,33** НСТ-индуциров., у.е./клетку 0,59±0,03 0,54±0,033 0,96±0,032* 0,51±0,013** функциональный резерв нейтрофилов 2,00±0,13 2,04±0,14 2,91±0,13* 2,06±0,09** активность фагоцитоза, % клеток 47,13±1,36 50,49±1,44 71,21±1,67* 50,01±1,24** интенсивность фагоцитоза, у.е./клетку 1,61±0,12 1,63±0,67 1,94±0,42* 1,64±0,29** Примечание: * - различие по показателям функциональной активности находящихся при естественном освещении и облученных искусственным светом нейтрофилов in vitro достоверно, р<0,05, ** - различие по показателям функциональной активности нейтрофилов, облученных светом, генерируемым люминесцентными лампами и светодиодами, находящихся при естественном освещении.

При анализе данных, полученных после 30-минутного воздействия света, генерируемого различными источниками, на функциональную активность нейтрофилов также не выявлено статистически значимых различий по показателям активности и интенсивности лизосомального аппарата нейтрофилов, фагоцитарной способности между лампами накаливания, светодиодами и естественным освещением. Отмечены значимые изменения активности нейтрофилов в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте, их фагоцитарной функции у клеток, облученных светом, генерируемым люминесцентными лампами, по сравнению с результатами, полученными при естественном освещении клеточной взвеси, воздействии лампами накаливания и светодиодами. Результаты исследования влияния различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro представлены в таблице 3.

Таблица 3 Влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro (время экспозиции 30 минут), (М±m) Показатели функциональной активности нейтрофилов Действие на нейтрофилы естественного освещения Действие на нейтрофилы светом, генерируемым лампами накаливания Действие на нейтрофилы светом, генерируемым люминесцентными лампами Действие на нейтрофилы светом, генерируемым светодиодами люминесценция лизосом, у.е 280,81±14,19 277,91±12,99 377,81±12,00* 280,91±11,98** активность лизосом, % 80,22±1,02 81,77±1,12 92,91±0,22* 83,69±1,13** НСТ-спонтанный, % клеток 22,09±1,51 23,00±1,11 46,05±1,09* 24,09±1,12** НСТ-спонтанный, у.е./клетку 0,27±0,02 0,26±0,004 0,47±0,03* 0,28±0,016** НСТ-индуциров., % клеток 50,00±1,16 51,22±1,13 76,47±1,20* 53,67±1,00** НСТ-индуциров., у.е./клетку 0,59±0,03 0,54±0,011 0,76±0,02* 0,51±0,01** функциональный резерв нейтрофилов 2,10±0,13 2,04±0,14 2,89±0,13* 2,06±0,19** активность фагоцитоза, % клеток 27,13±1,36 30,49±1,44 41,21±1,67* 30,01±1,24** интенсивность фагоцитоза, у.е./клетку 1,61±0,12 1,63±0,67 1,44±0,42* 1,64±0,29** Примечание: * - различие по показателям функциональной активности находящихся при естественном освещении и облученных искусственным светом нейтрофилов in vitro достоверно, р<0,05, ** - различие по показателям функциональной активности нейтрофилов, облученных светом, генерируемым люминесцентными лампами и светодиодами, находящихся при естественном освещении.

Таким образом, воздействие света, генерируемого лампами накаливания, светодиодными источниками света в пределах световой температуры 4000-4500 К, с интенсивностью светового воздействия 0,03 Вт/м² в диапазоне длин волн 320-400 нм в течение 10-30 минут не приводит к статистически значимому изменению функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, выделенных из периферической крови клинически здоровых людей-добровольцев при сравнении с естественным освещением. Воздействие на нейтрофилы света люминесцентных ламп приводит к активации кислородзависимого метаболизма и фагоцитарной активности по показателям активности НСТ-теста.

Применение способа оценки воздействия света, генерируемого светодиодными и иными искусственными источниками, на функции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови позволяет решить проблему лабораторного контроля эффективности и биобезопасности искусственных источников света, генерируемых лампами накаливания, люминесцентными лампами и светодиодами.

Предлагаемый способ отличается от существующих тем, что используя культуру клеток врожденного иммунитета, имеющих фоточувствительные рецепторы есть возможность более качественно, без использования человека как объекта при проведении исследований, в in vitro условиях лаборатории оценить биобезопасность искусственных источников света спрогнозировать возможные риски, возникающие при использовании люминесцентных ламп, светодиодов и ламп накаливания, при создании цветосветовой среды обитания человека. Ввиду дешевизны метода и простоты выполнения указанный способ оценки доступен большинству санитарно-гигиенических, иммунологических и микробиологических лабораторий.

Заявляемый способ может найти широкое применение в иммунологии, при проведении санитарно-гигиенической оценки освещенности, что свидетельствует о его соответствии критерию "промышленная применимость".

Литература

1. Анисимов В.Н. Эпифиз, биоритмы и старение организма / В.Н. Анисимов // Успехи физиологических наук. - 2008. - Т.39. - №4. - С.52-60.

2. Брейнард Г.К. Восприятие света как стимула незрительных реакций человека / Г.К. Брейнард, И. Провенсио // Светотехника. - 2008. - №1. - С.6-12.

3. Биске К. Субъективные оценки цветопередачи в зависимости от спектра излучения источников света / К. Биске, К. Вандаал, К. Юнгнич // Светотехника. - 2007. - №5. - C.14-17.

4. Гизингер О.А. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на нейтрофилы периферической крови доноров в условиях эксперимента / О.А. Гизингер, К.Г. Ишпахтина, О.Л. Колесников // Иммунология. - 2009. - Т.30, №5. - С.263-267.

5. Гизингер О.А. Исследовательские подходы в области безопасности освещения в условиях мегаполиса / О.А. Гизингер, М.В. Осиков, О.Р. Бокова, и др. // Полупроводниковая светотехника. - 2013. - Т.1, №21. - С.60-61.

6. Гизингер О.А. Функционально-метаболический статус нейтрофилов под воздействием лазерного излучения ИК-диапазона (850 нм) / О.А. Гизингер, К.Г. Ишпахтина, О.Л. Колесников // Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения: тр. науч. сессии, посвящ. 65-летию ЧелГМА. - Челябинск, 2009. - С.11.

7. Долгушин И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В. Бухарин; УрО РАН. - Екатеринбург, 2001. - 258 с.

8. Гигиенические характеристики энергосберегающих источников света [Электронный ресурс] / М.Э. Гусельников [и др.] // Энергетика: экология, надежность, безопасность: материалы докл. 14 Всерос. науч.-техн. конф., 9-11 дек. 2008 г., Томск - Томск, 2008. - Режим доступа: URL: http://www.lib.tpu.ru/fulltexVm/2009/m19.pdf#page=204, (дата обращения 30.05.2013).

9. Зак П.П. Потенциальная опасность освещения светодиодами для глаз детей и подростков / П.П. Зак, М.А. Островский // Светотехника. - №3 - 2012. - С.125-134.

10. Клебанов Г.И. Низкоинтенсивное лазерное облучение вызывает priming лейкоцитов / Г.И. Клебанов // Использование лазеров для диагностики и лечения заболеваний: сб. - М.: ЛАС, 1996. - С.11-14.

11. Козель А.И. Механизм действия лазерного излучения на тканевом и клеточном уровне / А.И. Козель, Г.К. Попов // Вестн. РАМН. - 2000. - №2. - С.41-43.

12. Кришталь B.C. Влияние цветности освещения на психофизиологическое состояние человека / B.C. Кришталь, Ф.П. Говоров // Свiтлотехнiка та електроенергетика. - №5. - 2005. - С.20-24.

13. Кудряшов Е.А. Применение вариабельности сердечного ритма для оценки организма и прогноза заболеваний / Е.А. Кудряшов, Л.М. Лавров // Нижегородский медицинский журнал. - №5. - 2008. - С.52-60.

14. Кучма В.Р. Гигиенические основы использования светодиодов в системах искусственного освещения / В.Р. Кучма, Л.М. Текшева // М. - ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, 2013. - 246 с.

15. Махмутхджаев А.Ш. Метаболические особенности форменных элементов крови после облучения низкоэнергетическим гелий-неоновым лазером / А.Ш. Махмутхджаев // Вопросы медико-биологических наук: сб. ст. по материалам науч. конф. «XXXII Евсеевские чтения». - Саранск, 1999. - С.60-64.

16. Методы изучения фагоцитарных клеток при оценке иммунологического статуса человека: учеб.-метод. пособие / под ред. И.С. Фредлин. - М., 1986. - 37 с.

17. Brainard G.C. Photoreception for regulation ofmelatonin and the circadian system in humans / G.C. Brainard // Fifth International LRO Lighting research symposium, Orlando. 2002. - C.23-26.

18. Karu T.I. Photobiological fundamentals of low-level laser therapy / T.I. Karu // IEEE J. Quant. Elect. - 1987. - Vol.QE-23. - P.1703-1717.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки влияния искусственного света на факторы врожденного иммунитета. Для этого оценивают влияние света, генерируемого светодиодами, лампами накаливания, люминесцентными лампами на нейтрофильные гранулоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров. На нейтрофильные гранулоциты, in vitro, действуют искусственным светом в пределах световой температуры 4000 К с энергетической освещенностью излучения 0,03 Вт/м² при длинах волн от 320 до 400 нм в течение различных временных интервалов. При этом регистрируют наличие или отсутствие изменений в виде повышения фагоцитарной, повышения лизосомальной активности, снижение биоцидных возможностей нейтрофилов, регистрируемых в тесте восстановления нитросинего тетразолия. Использование данного способа позволяет оценить биобезопасность новых искусственных источников света, внедряемых в цветосветовую среду обитания человека, используя культуру клеток врожденного иммунитета и исключая прямое участие человека. 3 табл.

Способ оценки воздействия искусственного света на функции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, включающий оценку эффективности и биобезопасности излучений оптического диапазона света, генерируемых светодиодами, люминесцентными лампами, лампами накаливания с цветовой температурой 4000 К с энергетической освещенностью излучения 0,03 Вт/м² в диапазоне длин волн 320-400 нм в течение различных временных интервалов, отличающийся тем, что проведен на культуре нейтрофильных гранулоцитов, выделенных из периферической крови доноров, при котором регистрируют наличие или отсутствие изменений в виде повышения фагоцитарной, повышения лизосомальной активности, снижение биоцидных возможностей нейтрофилов, регистрируемых в тесте восстановления нитросинего тетразолия.