Способ определения альфа-токоферола в бислойных липидных мембранах Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 A61K31/355 

(Л

с

Изобретение относится к биохимии. Лдя раздельного определения / токоферола в наружном и внутреннем монослоях бислойньЕХ ЛИПИДНЫХ мембран из одной части исследуемой пробы экстрагируют липидрастворимые соединения и определяют содержание «( -токоферола, К другой части добавляют ферри1щанид калия, экстрагируют пиды и определяют содержание ef -токоферола во внутреннем монослое. Содержание (/-токоферола в наружном монослое определяют по разности его суммарного содержания и содержания во внутреннем монослое. 1 табл.

СА:

00

1

I Изобретение относится к биохимии И может быть использовано для раз- qienbHoro определения альфа-токоферо- 4а (витамина Е) в наружном и внутрен йем мопослоях искусственньгх и природ (1ЫХ бислойных липидчых мембран.

Цель изобретения - раздельное определение альфа-токоферола в наружно и внутреннем мо шслоях бислойных ли- видных мембран.

I Способ осуществляется следующим |эбразом.

Из одной части исследуемой пробы экстрагируют липидрастворимые соеди- нения, в экстракте флюориметрически определяют общее содержание альфа- токоферола. Затем в другой части исследуемых мембран проводят селектив|ное окисление альфа-токоферола наруж

jHoro монослоя мембран. Ферридианидом

I калия экстрагируют липиды и флюориI метрически определяют в экстракте соI держание альфа-токоферола во внутреннем монослое. Содержание альфа-токо- ферола п наружном монослое определя

3,7 7,2 10,8

14,5

18,2 29,8

1(0 2,0 3,0 4,0 5,0 8,0

На следующем этапе процедуры включают альфа-токоферол в наружный и внутренний монослой бислойных липид- ных везикул, сформированных из липи- дов плазматических мембран синапто- сом -мозга крысы. Для этого берут 1,0 мл раствора хлороформа, содержа- щего 10 мг фосфолипидов, и смешивают с 1,0 мл хлороформа, содержащего 10 мг альфа-токоферола. Смесь упаривают досуха в токе аргона, затем добавляют 10,0 мл среды следующего с остава: (, NaCl (100 Mil), рН 7,4, интенсивно встряхивают 3-5 мин. Полученную суспензию подвергают ультразвуковой дезинтеграции на ультразвуковом дезинтеграто ре УЗДН-2 (режим работы 22 кГц, воздействие, ультразвуком по 15с в течение 10 мин при 0-4°с). После ультразвуковой обработки суспензию центрифугируют 20000 g, ,0 мин. Супарна- тант представляет собой бислойные липидные везикулы, в наружный и внутренний монослой которых включен альфа-токоферол.

295 нм А

ют по разности его суммарного содержания и содержания во внутреннем монослое „

Пример 1. На нервом этапе процедуры строят калибровочную зависимость интенсивности флюоресденции альфа-токоферола от его количества. Лдя этого берут навеску альфа-токоферола 10 мг и растворяют в 10 нп метанола. Из этого, раствора берут микрошприцом разное количество альфа токоферола (1, 2, 3, 4j 5, 8 мкл) и каждую добавляемую часть смешивают с 3,0 мл метанола. В приготовленных образцах регистрируют интенсивность флюоресценции альфа-токоферола на спектрофлюориметре HITACHI MPF-2A4 Условия регистрации следуюп;ие: спектральная гшрина щелей 4 нм; А возя

эмисс. 325 ИМ; в 1 см кюветы объемом 3,0 мл при комнатной температуре.

Значения интенсивности флюоресценции от содержания альфа-токоферола приведены в таблице.

14,5

18,2 29,8

В полученных липидных везикулах определяют суммарное количество альфа-токоферола. Для этого берут 5,0 м супернатанта и разделяют на пять параллельных проб по 1,0 мл, затем экстрагируют липиды по методу Фолча, Смеси упаривают досуха в токе аргона и растворяют каждую пробу в 3,0 мл метанола. Для измерения флюоресценции альфа-токоферола образцы р-азво- дят в 20 раз, берут микрошприцом из каждой пробы по 150 мкл и смешивают с 2,85 мл метанола. Измеряют интенсивность флюоресценции, которая составляет; 16,5 16,2; 16-, 0; 16,0; 17,8 отн.ед,, что соответствует содержанию альфа-токоферола 4,5; 4,4; 4,3; 4,3; 4,8 мкг. Учитывая разведение образцов в 20 раз, получают суммарное количество альфа-токоферола в мембране 89,2+3,0 мкг.

Для определения содержания альфа- токоферола во внутреннем монослое бислойных везикул необходимо провести окисление альфа-токоферола, нахо- дяпегося в наружном монослое. К пяти

оставшимся параллельным образцам, содержащим по 1,0 мл суспензии, цо- бапляют микрошприиом по 10 MKJT раствора феррпЦиаиида калия до К(:1нечной концентрации 2-10 М, пкремошивают и через 4-5 мин проводят экстракцию липидов по методу Фолча. Смеси липи- дов упаривают досуха в токе аргона, и растворяют в 3,0 мп метанола. Но- луче1иц.1е образцы разводят в 20 раз, смешивая 150 мкл образца с 2,85 мл метанола и измеряют Т1нтенсив ность флюоресценции альфа-токоферола которая составляет: 13,2 12,8; 12,9 12,4j 13,4 отн.ед., что соответствует содержанию альфа-токоферола 3,6, 3,4-, 3,5, 3,3-, 3,6 мкг. Учитывая разведение образцов в 20 раз, получают содержание альфа-токоферола во внут- реннем монослое 69,6+2,1 мкг, что составляет 78% от суммарного содержания альфа-токоферола в мембране,

Таким образом, в приготовленных бислойных липиднЕ 1х везикулах альфа- токоферола локализуется преимущест- BeFiHO во внутреннем монослое, что указывает на его асимметричное распределение. Для определения содержания альфа-токоферола в наружном мо- нослое необходимо вычесть из суммарного количества альфа-токоферола его количество во внутреннем монослое: 89,2-69,,6 мкг, что соответствует 22% от общего количества.

Пример 2, Берут 1,0 мп раствора хлороформа, содержащего 10 мг фосфолип1щов, упаривают досуха в токе аргона и добавляют 10 мл среды следующего состава: трис-НС1 (20 мГ1) NaCl (100 мГ1) рН 7,4, интенсивно встряхивают 3-5 мнн. Полученную сусг пензию подвергают ультразвуковой обработке на УЗДН-2 (режим работы: 22 кГц, воздействие ультразвука по 15 с в течение 10 мин при 0-4°С). После ультразвуковой обработки суспензию центрифугируют 20000 g, 20 мин Супернатант представляет собой би- слойные липидные везикулы, к которым добавляют этанольньш раствор альфа- токоферола Для этого к 10 МП супер- натанта, содержап1его 5 мг фосфолипи- дов, добавляют 100 мкл раствора эта

ноля, содержащего 1 мг альфа-токоферола. Смесь интенсивно перемешивают 5-10 мин. Затем определяют суммарное количество альфа-токоферола в би- слонньк липтсдных везикулах. Берут

Q 5 0

5 о

д g

5

5

параллельных по 1,0 мл и экстрагируют 1Н1пиды по методу Фолча. Смеси липидов упаривают досуха в токе аргона и растворяют в 3,0 мл метанола. Для измерения интенсивности флюоресценции а.чьфа-токофсрола образцы разводят в 20 раз: берут из каждой пробы по 150 мкл,смешивают с 2,85 мл метанола и регистрируют интенсивность флюоресценции. Условия регистрации и калибровочная зависимость интенсивности фJтюopecцeнции от содержания альфа-токоферола рассмотрены и приведены в примере 1. После измерения получаем следуюгще значения интенсивности флюоресценции: 18,5; 18,1) 17,8; 17,8; 17,4 отн.ед., что соответствует содержанию альфа-токоферола 5,0; 4,9 4,8; 4,8; 4,7 мкг. Учитывая разведение образцов в 20 раз получают суммарное количество альфа-токоферола 97,2+1,4 мкг.

Для определения содержания альфа- токоферола во внутреннем монослое берут остальные 5 мл суспензии би- слойных везикул, разделяют на пять параллельных проб и к каждой пробе добавляют по 10 мкл феррицианида калия до конечной концентрации 2-10 М перемешивают и через 4-5 мин проводят экстракцию липидов по методу Фолча. Смеси липидов упаривают досуха в токе аргона, затем каждый образец растворяют в 3,0 мл метанола и регистрируют интенсивность флюоресценции. Наблюдают отсутствие флюоресценции вследствие полного окисления альфа- токоферола. Следовательно, при включении альфа-токоферрла в бислойные липидные везикулы альфа-токоферол распределяется асимметрично и локализован исключительно в наружном монослое.

Пример 3. Определение содержания альфа-токоферола в наружном и внутреннем монослоях плазматических мембран синаптосом мозга крысы. Плазматические мембраны синаптосом мозга гомогенизируют в гомогенизаторе стекло-тефлон в 10,0 мл среды следующего состава, трис-НС1 (40 мМ), NaCl (100 мМ), рН 7,4. В суспензии мембран с концентрацией белка 1 мг/мл определяют суммарное количество альфа- токоферола. Для этого берут пять параллельных проб, содержащих по 1,О мл суспензии, и экстрагируют ли- пиды по методу Фолча. Смесь липидов

упаривают досуха в токе аргона и растворяют каждую пробу в 3,0 ш метанола. Для измерения интенсивности флюоресцен1щи альфа-токоферола образ цы разводят в 2 раза: берут из каждо ;пробы по 1,5 МП и смешивают с 1,5 мл метанола. Условия регистрации интен- ;сипности флюоресценции и зависимость Калибровочной кривой интенсивности флюоресценции от содержания альфа- токоферола рассмотрены и приведены в примере 1. Измеряют интенсивность флюоресценции, получают 15,9j 16,3 15,2j 15,1; 16,5 отн.ед., что соот- |ветствует содержанию альфа-токоферо- па 4,3; 4,4; 4,1; 4,1j 4,5 мкг, учитывая разведение в 2 раза получают суммарное количество альфа-токоферо- |ла в мембране 8,6+0,3 мкг. I ,Для определения содержания альфа- токоферола во внутреннем монослое плазматических мембран синаптосом необходимо провести окисление альфа- токоферола, находящегося в наружном 1мопослое„ К пяти параллельным образ- |цам, содержащим по 1,0 ип суспензии мембран, добавляют по 10 мкл ферри- |Щ1анида калия до конечной концентра- |ц11и .2 . Перемешивают и через 14-5 мин проводят экстракцию липидов по методу Фолча, смеси .липидов упа- |ривают досуха в токе аргона и. затем |растворяют в 3,0 МП метанола. В при35

готовленных образцах регистрируют |флюоресценцию альфа-токоферола на ;спектрофлюориметре. Получают значения интенсивности 22,6; 21,7j 23,5 21,8-, 21,5 отн.ед., что соответствует со- деряанию альфа-тГокоферола 6,1; 5,9; дО 6,3; 5,9; .5,8 мкг, таким образом со- дерка гие альфа-токоферола во внутрен

нем ртонослое плазматических мембран синаптосом мозга соответствует величине 6,0±0,3 мкг, что составляет 70% от суммарного содержания альфа-токоферола в мембране.

Таким образом, в плазматических мембранах синаптосом мозга крысы альфа-токоферол локализован преимущественно во внутренне монослое, что указьгаает на асимметричное его распределение в мембране. Для определения содержания альфа-токоферола в наружном монослое необходимо вычесть из суммарного количества альфа-токоферола его количество во внутреннем монослое: 8,6-6,,6 мкг, что соответствует 30% от общего количества.

,

20 Формула изобретения

Способ определения альфа-токоферола в бислойнык липидных мембранах путем экстракции липидорастворимых соединений исследуемых мембран с последующим флю.ориметрическим анализом экстракта, отличающийся тем, что, с целью раздельного определения альфа-токоферола в наружном и внутреннем монослоях, в одной части исследуемой пробы определяют суммарное количество альфа-токоферола, другую часть обрабатывают феррициа- нидом калия, затем экстрагируют лили-, ды и по интенсивности флюоресценции экстракта определяют содержание альфа-токоферола во внутреннем монослое, а содержание альфа-токоферола в наружном монослое определяют как разность между общим содержанием альфа- токоферола и его содержанием во внутреннем монослое.