Способ стабилизации синаптосом Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

оо оо

00 1С

1 .

Изобретение относится к области биологии, в частности к физико-химической биологии, касается способа устранения повреждения биологически мембран, вызванных действием фосфо

:липаз, И может быть использовано для оптимизации длительного хранения препаратов биологических мембран.

Цель изобретения - упрощение спо- |Соба за счет сокращения числа операций при одновременном сокращении вре ,мени инкубации.

Способ осуществляют следующим об- разом,

К суспензии синаптосом добавляют спиртовой раствор альфа-токоферола из расчета 10 моль/мг синаптосо- мального белка и инкубируют 3-5 мин. Объем добавленного, этанола не должен превышать 1%. Пример. Серое вещество мозга крыс Вистар гомогенизируют в среде Кребса-Рингера, затем центрифугируют 10 мин при 3000 g для удаления ядер и неразрушенных клеток. Полученный супернатант центрифугируют в градиен ,те плотности (0,3 и 0,8 .М) сахарозы

Из данных, представленных в табли це, видно, что обработка фосфолипаза- ми А и С, соответствующая 20-25% гидролиза фосфолипидов, ведет к снижению микровязкости липидного бислоя

при 10000 g 20 мин для отделения митохондрий, которые соответствуют плот-30 синаптосом, оцениваемой по времени ности 0,3 М сахарозы. Слой 0,8 М са- вращательной корреляции Сс спинового харозы, содержащий синаптосомы, отде- зонда - нитроксил-содержащего эфира, ляют и центрифугируют при 10000 g в

сте.ариновой кислоты. Аналогичная по интенсивности обработка фосфолипазов D не приводит к изменению микровязкости липидного бислоя синаптосо- мальных мембран.

течение 10 мин, а затем ресуспендируют в среде Кребса-Рингера. К 1 полученных таким образом синаптосом, обработанных фосфолипазой мкг белка, степень обработки соответствует 7-25%), добавляют 3

10 моль альфа-токоферола в 10 мкл этанола и инкубируют 4 мин.

Важнейшей структурно-функциональной характеристикой мембран синаптосом является их трансмембранный посом. Через 3-5 мин после введения альфа-токоферола в количестве 10 моль/мг синаптосомального белка наблюдается снижение величины потенциал-зависимой флуоресценции di-S-C,- (5) до исходного уровня, т.е. полное восстановление величины трансмембранного потенциала, сниженной в результате действия фосфолипаз, что свидетельствует об устранении их повреждающего действия.

Другой важной характеристикой си- наптических мембран, определяющей подвижность мембранных рецепторов и регулирующей активность интегральных ферментов, является микровязкость липидного бислоя.

В таблице ука зано изменение времени вращательной корреляции нитроксил- содержащего эфира стеариновой кислоты С, встроенного в мембраны синаптосом мозга крыс, при действии фосфолипаз и о -токоферола при 37°С.

Из данных, представленных в таблице, видно, что обработка фосфолипаза- ми А и С, соответствующая 20-25% гидролиза фосфолипидов, ведет к снижению микровязкости липидного бислоя

синаптосом, оцениваемой по времени вращательной корреляции Сс спинового зонда - нитроксил-содержащего эфира,

синаптосом, оцениваемой по времени вращательной корреляции Сс спинового зонда - нитроксил-содержащего эфира,

сте.ариновой кислоты. Аналогичная по интенсивности обработка фосфолипазов D не приводит к изменению микровязкости липидного бислоя синаптосо- мальных мембран.

При 37°С уменьшение микровязкостй липидного бислоя мембран синаптосом вьфажается в снижении времени вращательной корреляции зонда .с 2,5 -1 О до 2,. Введение альфа-токоферола в количестве 10 моль/мг синаптосомального белка к синаптосомам,

Изобретение относится к физико- химической биологии, касается способа устранения повреждения биологических мембран, вызванных действием фос- фолипаз, и предназначен для оптимизации длительного хранения препаратов биологических мембран. Цель изобретения - упрощение способа за счет сокращения числа операций при одно- временн ом сокращении времени инкубации. Для этого к суспензии синапто- сом добавляют спиртовой р-р альфа- токоферола из расчета 10 ,моль/мг синаптосомального белка и инкубируют 3-5 мин. Объем добавленного этанола не должен превышать 1%. 1 табл. S сл

тенциал. Обработка синаптосом фосфо- .с обработанным, фосфолипазами, приво- лш1азами An, С или D приводит к изменению величины трансмембранного потенциала, оцениваемой по изменению флуоре сценции потенциал-чувствитель- ного флуоресцентного зонда 3,3-дипро-. пил-2,2-тиокарбоцианида (di-S-C,-(5) . Действие фосфолипаз А„, С или D приводит к увеличению интенсивности по- тен1.щал-зависимой флуоресценции di- 5-Сэ-(5), что соответствует снижению „ липаз, что свидетельствует об устрадит к увеличению микровязкости липидного бислоя. Это вьфажается в увеличении времени вращательной кор реляции спинового зонда до 11,0; к10 с. Таким образом, введением альфа-токоферола достигается увеличение микровязкости липидного бислоя мембран синаптосом, была снижена в результате действия фосфовеличины трансмембранного потенциала. При 7-10% гидролиза фосфолипидов фосфолипазами А, С или D наблюдается максимальная деполяризация синаптонении их повреждающего действия.

Предлагаемый способ обеспечивает быстрое и эффективное устранение повреждающего действия фосфолипаз разобработанным, фосфолипазами, приво- липаз, что свидетельствует об устрадит к увеличению микровязкости липидного бислоя. Это вьфажается в увеличении времени вращательной кор реляции спинового зонда до 11,0; к10 с. Таким образом, введением альфа-токоферола достигается увеличение микровязкости липидного бислоя мембран синаптосом, была снижена в результате действия фосфообработанным, фосфолипазами, приво- липаз, что свидетельствует об устранении их повреждающего действия.

Предлагаемый способ обеспечивает быстрое и эффективное устранение повреждающего действия фосфолипаз различного типа на синаптосомы мозга. Преимущества предлагаемого способа - простота, высокие скорость и эффективность, широкий спектр действия. . Тот факт, что предлагаемьй способ обеспечивает восстановление таких параметров, измененных при действии фосфолипаз, как микровязкость и трансмембранный потенциал, которые определяют структурно-функциональное состояние различных биологических мембран, означает что он может быть использован для стабилизации различных мембранных препаратов от повреж- дающего действия фосфолипаз.. В частности, данньй метод может быть использован при длительном хранении препаратов биомембран, когда они повреждаются в результате действия эндо- генных фосфолипаз.

Формула изобретения

Способ стабилизации синаптосом пу- тем добавления в суспензию синаптосом агента, связывающего продукты гидролиза фосфолипидов с последующей инкубацией, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за

счет сокращения числа операций при одновременном сокращении времени инкубации, в .качестве агента используют альфа-токоферол в этанольном растворе, взятый в соотношении 10 моль/мг синаптосомального белка, причем конечный объем зтанола не превьшает 1%, а время инкубации составляет 4±1 мин.

Время вращательнойкорреляции зонда с

1Интактные синаптосомы 2,

-ч

Синаптосомы, обработанные фосфолипазой А 7

Синаптосомы, обработанные фосфолипаЗОЙ С

Синаптосомы, обработанные фосфолипазой ,D -10

-9

Синаптосомы, обработанные фосфолипазой А,,, С или D + альфа-токоферол 11,0-10

-9