Способ определения триптофансодержащих соединений и метаболитов триптофанового ряда в ликворе Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

00 ;о 4;

00 а

; Изобретение относится к медицине, В| частности к методам биофизических исследований ликвора, и может быть 1|спользовано в научно-исследователь- с1ких лабораториях и клинике с диагно- йтической целью.

Цель изобретения - упрощение способа за счет сокращения числа трудоемких операций. i Способ осуществляют следующим об- )азом.

При комнатной температуре в кварцевую кювету флюоресцентного спектрофотометра (модель MPF-4 HITACHI, ния) напивают 1,5 мл дистиплированной воды, добавляют 0,5 мп исследуемой жидкости. Находят максимум длины волны возбуждающего .света ( возг.) Для ликвора человека оъб. 280-300 нм. 20 В водных растворах этот диапазон соответствует Двоз5. триптофана 280 нм, возб окисленных форм триптофана (се- ротонин) 300 нм.

При фиксированной возб. записьтают25 спектр флюоресценции исследуемой жидкости. Находят максимум длины волны флюоресценции ( Дфлюор,). Для ликвора человека Л лц,ор. 335-341 нм. В водных растворах Д фд„,ор.триптофанаЗО 350 нм, Л окисленных форм триптофана (5-окситриптофан, серото- нин) 335 нм.

Фиксируют положение монохроматора детектора флюоресценции в соответствии с найденной флц5ор

В течение выбранного отрезка времени (4 мин) исследуемая проба облучается монохроматическим лучом ультрафиолета (УФ) -и одновременно не- прерывно эаписьюается динамика квантового выхода (интенсивность) флюоресценции на длине волны Л с(лк)ор режим фотоокисления флюоресцирующего субстрата (К.,).

В кювету к исследуемой жидкости добавляют перекись водорода (25 мкл) и также в течение 4 мин облучают монохроматическим УФ при Л6036 300 нм.

Исследуют жидкость с добавленной к ней перекисью водорода - режим фо- 50 тохимического окисления флюоресцирующего субстрата (Кл).

По начальным и конечным значениям точек кривых находят значения констант скоростей: фотоокисления фпюо- 55

ресцирующего субстрата К ---; Фотохимического окисления флюоресциру35

Q

5 0

5 О

0

5

5il

где л I 5

ющего субстрата К

разница интенсивностей флюоресценции. : При К ;| О, Кг70 источником флюоресценции является триптофан, а при , К 2 О источником флюоресценции являются окисленные формы триптофана.

Продолжительность исследования 10-12 мин.

П р и м е р 1. Больной Шурыгин, 62 года. Люмбальная пункция. Ликвор прозрачный. Диагноз - склероз сосудов головного мозга.

При комнатной температуре в квар-. цевую кювету флюоресцентного спектрофотометра наливают 1,5 мл дистиллированной воды и добавляют 0,5 мл исследуемого ликвора.

Находят максимум длины волны возбуждающего света .АВОЗ 290 нм. Фиксируют Л 5035 290 нм и записывают спектр флюоресценции разведения лик- вора больного.

Находят максимум длины волны флуоресценции 335 нм. Фиксируют положение монохроматора детектора флюоресценции ( Д флюор- 335 нм). В течение 4 мин. облучают разведение Ликвора монохроматическим лучом УФ (290 нм) и одновременно записывают- динамику г квантового вьгхода интенсивности флюоресценции на длине волны 335 нм - режим фотоокисления разведения ликвора.

В кювету с разведением ликвора добавляют перекись водорода в объеме 25 мкл и также в течение 4 мин облучают монохроматическим ультрафиолетом при Дбозб 290 нм. I

По начальным и -конечным значениями точек кривых определяют значение констант скоростей: фотоокисление

ах К, -; (31 0; К О и фотохимиЛ1

ческое окисление К -i Л1 0;

Kj7 0.

Заключение: в ликворе больного присутствует триптофан.

П р и м е р 2. Больной Семенов, 23 года. Люмбальная пункция. Ликвор ксантохромный. Диагноз - менингит.

При комнатной температуре в кварцевую кювету флюоресцентного спектрофотометра наливают 1,5 нл дистиллированной воды и добавляют 0,5 мл исследуемого ликвора. Находят макси- ма.льную длину волны возбуждающего

света Дjos6 90 нм. Фиксируют 8oj6 записывают спектр флуоресценции разведения ликвора.

Находят максимум длины волны флюоресценции Л флюор 335 нм. Фиксируют положение монохроматора детектора флюоресценции ( 335 нм).

В течение 4 мин исследуемая проба ликвора облучается монохроматическим лучом ультрафиолета ( Aeojff. 290 нм и одновременно непрерывно записывается динамика квантового выхода (интенсивность) флюоресценции на длине волны Лфлкюр 335 нм - режим фото- окисления флюоресцирующего субстрата (К,).

В кювету с исследуемым разведением ликвора добавляют перекись водорода (25 мкл) и также в течение 4 ми облучают исследуемую жидкость с добавленной к ней перекисью водорода при А Boas Q м - режим фотохимического окисления разведения ликвора (К,).

При К,70 и К-1 О в ликворе присутствуют окисленные формы триптофана.

Преимуществами предлагаемого способа являются простота, специфичност способа, которая обеспечивается проведением фото- и биохимического окисления исследуемой жидкости при Л g.jд- и , соответствующих фромофо- рам триптофанового ряда, чувствительность, позволяющая обнаружить не менее флюоресцирукнцего субстрата при использовании флюориметра с техническими параметрами, аналогичными МГГ-4, минимальный используемый объем ликвора 0,1 мл, продолжительность исследования 10-12 мин.

Ф о р-м ула изобретения

Способ определения триптофансодер- жащих соединений и метаболитов триптофанового ряда в ликворе путем обработки ликвора химическим агентом с последующей регистрацией флюоресценции, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа трудоемких операций, в качестве реагента используют перекись водорода, определяют константы скорости снижения интенсивности флюоресценции во времени: константу фотоокисления К и константу фотохимического окисления К, причем при К ОиК,0 определяют триптофан- содержащие белки, а при , метаболиты триптофанового ряда.

Изобретение относится к медицине, точнее к биофизическим исследованиям ликвора, предназначено для использования в научно-исследоватепь- ских лабораториях и клиниках с диагностической целью. Цель изобретения- упрощение способа путем сокращения числа трудоемких операций. Для этого; ликвор обрабатьтают химическим реагентом, регистрируют флюоресценцию. Находят максимум длины волны возбуждающего света (Ago). В водных р- рах этот диапазон соответствует Л ggjj триптофана 280 нм soss окисленных форм триптофана (серотонина) 300 нм. В качестве реагента используют перекись водорода и в течение 4 мин кювету с разведением ликвора облучают монохроматическим лучом ультрафиолета при А вози- 290 нм. Определяют константы скорости снижения интенсивности флюоресценции во времени: константу фотоокисления К, и константу фотохимического окисления К. При К О и Kj O определяют триптофансодержащие белки, при К; О, К 2 т О - метаболиты триптофанового ряда. сл