СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ КОНТАМИНАЦИИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/22 G01N21/64 

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, медицинского материаловедения, пищевой и фармацевтической промышленности и может быть использовано для прямого определения микробной контаминации и/или компонентов культуральной среды.

Бактериальная целлюлоза (БЦ) - природный полисахарид, состоящий из мономеров (1,4)-β-D-глюкопиранозы (циклической формы глюкозы), две молекулы которых, соединенные β-глюкозидной связью, образуют первичное звено целлюлозы - целлобиозу (дисахарид), из которой и собираются нанофибриллярные волокна, продуцируемые аэробными, грамнегативными микроорганизмами, в основном принадлежащими к роду бактерий семейства Acetobacteraceae, а именно вида Komagataeibacterxylinus, представители которого наиболее способны к продуктивному синтезу целлюлозы (Betlej I., Zakaria S., Krajewski K., Boruszewski P. Bacterial cellulose -properties and its potential application. Sains Malaysiana.2021; 50 (2): 493-505. doi: 10.17576/jsm-2021-5002-20). В химическом плане БЦ отличается исключительной чистотой, так как не содержит в сравнении с растительной целлюлозой таких примесей, как лигнин, гемицеллюлоза и пектин (GRAS Notice for Fibrillated Cellulose (GRN). 2020; No. 954. 75 p. https://www.fda.gov/food/generally-recognized-safe-gras/gras-noticeinventory).

В то же время бактериальная целлюлоза к окончанию синтеза контаминирована бактериями - продуцентами целлюлозы и их компонентами.

В широком смысле микробная контаминация предполагает загрязнение, материалов, лекарств, продуктов питания, воздуха, воды - бактериями, грибами, вирусами, простейшими, микробными токсинами, а также продуктами микробного метаболизма и/или их катаболизма.

Общепринятыми методами микробиологического определения микроорганизмов контаминирующих твердые материалы или поверхности на начальном этапе является изучение смывов с окрашиванием по Граму и последующей микроскопией, анализом тинкториальных свойств найденных микробов с подключением специальных методик окрашивания. При комплексном микробиологическом изучении микроорганизмов используются дифференциально-диагностические питательные среды с уточнением видоспецифичности микробов (Бынина М.П., Андрюков Б.Г., Матосова Е.В., Ляпун И.Н., Дробот Е.И. Сравнительная оценка дифференциально-диагностических свойств среды Серова и основы селективного агара для выделения энтеропато генных иерсиний.// Клиническая лабораторная диагностика. 2018. Т. 63. №9. С. 564-567, doi: 10.18821/0869-2084-2018-63-9-564-567).

Другой группой альтернативных методов установления микробной контаминации являются методы с использованием флюоресцентного и иммунофлюоресцентного окрашивания против видоспецифических антигенов изучаемых микробов (W.R. Sanborn, Claus Chr. Heuck, Raja El Aouad, Wulf B. Storch Fluorescence microscopy for disease diagnosis and environmental monitoring.// WHO Regional Publications, Eastern Mediterranean, 2005; Series 28 pp. 327. ISBN: 978-92-9021-395-6).

К биохимическим методам, которые могут быть использованы для определения микробной контаминации относят высокоэффективную жидкостную хроматографию с помощью которой можно так же определять бактериальные метаболиты (High-performance liquid chromatography of microbial acid metabolites.// Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications - 1984, Vol. 336, Issue 1, P. 125-137, https://doi.org/10.1016/S0378-4347(00)85136-1). К этой же группе можно отнести масс спектрометрию (Z. Mielniczuk, Z. Pogorzelska Detection of microbial contamination of packaging for foodstuffs by gas chromatography-mass spectrometry method// Packaging Technology and Science, 2002, Vol. 15 (1) - P.47 - 51. DOI:10.1002/pts.566).

И наконец, молекулярно-генетические методы, количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (q-RT-PCR), который является чувствительным методом, обнаруживающим РНК с низким числом копий и может применяться для обнаружения, микроорганизмов по уровню экспрессии специфических генов, а так же мультиплексная PCR позволяют достаточно оперативно определять микробную контаминацию (Marelize Botes, Michele de Kwaadsteniet, and Thomas Eugene Cloete //Anal Bioanal Chem. 2013; 405(1): 91-108. doi: 10.1007/s00216-012-6399-3; Prem Shankar, Jyotsna Mishra, l Vijaya Bharti, Deepak Parashar, and Sarman Singh Multiplex PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, and Salmonella spp. in the municipality-supplied drinking water.//J Lab Physicians; 11 (3): 275-280. doi: 10.4103/JLP.JLP_66_18).

Также настоящему времени доказано что все прокариотические и эукариотические клетки обладают собственной естественной флюоресценцией (аутофлюоресценцией) из-за присутствия различных флюоресцентных клеточных структурных компонентов и метаболитов, таких как флавины, никотинамид адениндинуклеотид (НАД), ароматические аминокислоты, липофусцины, конечные продукты гликозилирования (Croce, А.С. & Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: a tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem 58, 2461 (2014), DOI: 10.408l/ejh.2014.2461; Larionov Р.М, А.N. Malov, N.A. Maslov, M.M. Mandrik, A.M. Orishich Changes in the Laser-Induced Fluorescence Spectrum of Myocardium Tissue with Decrease in Its Viability Journal of Applied Spectroscopy 70 (1): 38-42 (2003), DOI:10.1023/A.T023212206592; Surre, J., Saint-Ruf, C, Collin, V. et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Sci Rep 8, 12088 (2018), DOI:doi.org/10.1038/s41598-018-30623-2).

Более того, в ряде исследований показано эффективное обнаружение бактерий, с использованием лазерно-индуцированной флюоресцентной (ЛИФ) спектроскопии, которая обладает высокой эффективностью и чувствительностью для обнаружения бактерий с доминирующим вкладом в характерологические спектры - ароматической аминокислоты триптофана и флавина. (Du R., Yang D., Yin X. Rapid Detection of Three Common Bacteria Based on Fluorescence Spectroscopy. Sensors. 2022; 22 (3): 1168. https://doi.org/10.3390/s22031168; Ammor, M.S. Recent Advances in the Use of Intrinsic Fluorescence for Bacterial Identification and Characterization. J Fluoresc 17, 455-459 (2007). https://doi.org/10.1007/s 10895-007-0180-6). Однако в этом исследовании требуется выделение бактерий, а также последующая оптимизация условий проведения испытаний, т.к. калибровка растворов с различными бактериальными титрами выполняется в деионизированной воде. Метод не ориентирован на определение микробной контаминации твердых материалов.

Является общепринятым при использовании БЦ в биомедицинских и исследовательских целях химический метод очистки с разными концентрациями гидроксида натрия (NaOH) с различной экспозицией, температурными режимами и этапами отмывок (Zakaria H.N., Mohamad J., Mohamad S.S., Fathiyah S., Mohd H. Effect of different treatment methods on the purification of bacterial cellulose produced from OPF juice by acetobacter xylinum. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 2021; 1092 (1): 012058.doi: 10.1088/1757-899X/1092/1 /012058; Helenius G, Backdahl H, Bodin A, Nannmark U, Gatenholm P, Risberg B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. J Biomed Mater Res A. 2006; 76 (2): 431-438. DOI: 10.1002/jbm.a.30570). Считается, что процесс очистки БЦ с помощью NaOH происходит за счет лизиса клеток всех бактерий-продуцентов (Cubas A.L.V., Bianchet R.T., de Oliveira D., Leonarski E., Cesca K. Application of non-thermal plasma as an alternative for purification of bacterial cellulose membranes. Sustainable Chemistry and Pharmacy.2022; 29 (1): 100800. doi: 10.1016/j.scp.2022.100800). В то же время БЦ может проявлять иммуногенность, связанную с контаминацией эндотоксином грамотрицательных бактерий-продуцентов и компонентом их бактериальной стенки (1,3)-β-D-гликаном (Liu J., Bacher М., Rosenau Т., Willfor S, Mihranyan A. Potentially immunogenic contaminants in wood-based and bacterial nanocellulose: assessment of endotoxin and (1,3)-β-d-Glucan Levels. Biomacromolecules. 2018; 19(1): 150-157. DOI: 10.1021/acs.biomac.7b0133).

Таким образом, проведение химической очистки не гарантирует отсутствие контаминации БЦ. Поэтому требуется мониторинг контаминации БЦ до полной ее очистки.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения бактериальной контаминации материала (патент РФ №2208645, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.07.2003, Бюл. №20), согласно которому выделяют ДНК и проводят с ней полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В ПЦР используют праймеры на общую для всех бактерий нуклеотидную последовательность (НП), а реакцию проводят в присутствии внутреннего стандарта конкурентного типа. Выявляют сигналы от внутреннего стандарта и общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности и при наличии сигналов одновременно от внутреннего стандарта и общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности определяют бактериальную контаминацию крови, а при наличии сигнала от одного внутреннего стандарта - отсутствие бактериальной контаминации.

Способ по патенту РФ №2208645 позволяет повысить точность определения контаминации материалов.

Недостатком данного способа является невозможность определения микробной контаминации, которая помимо бактерий должна включать определение грибов, что актуально для очищения целлюлозы, так, дрожжевые грибы могут являться участниками микробного консорциума при синтезе бактериальной целлюлозы, например при использовании симбиотического консорциума Medusomyces gisevii, состоящего из Gluconacetobacter sp., Acetobacter sp., Zygosaccharomyces sp., а так же дрожжевых грибов, общие генетические маркеры между бактериями и грибами отсутствуют, дополнительным недостатком этого метода является финансовая и временная затратность.

Задача (технический результат) предлагаемого изобретения заключается в повышении точности определения микробной контаминации бактериальной целлюлозы (БЦ) при упрощении процедуры для обеспечения контроля на этапах очистки БЦ.

Поставленная задача решается тем, что способ определения микробной контаминации целлюлозы бактериального происхождения (БЦ) заключается в определении наличия или отсутствия специфической микробной флуоресценции. Согласно предлагаемому изобретению используются волны: λех - длина волны возбуждения и λem - длина волны испускания. Исследуемый образец облучают источником света с длиной волны излучения находящейся в диапазоне (λех) 193-310 нм, регистрируют флюоресценцию, исходящую от образца, при регистрации флюоресценции в спектральной полосе 321-350 нм диагностируют наличие в образце триптофана. При регистрации ответного излучения в спектральной полосе (λem) 295-299 нм диагностируют наличие в образце тирозина. При регистрации ответного излучения в спектральной полосе (λem) 300-320 нм диагностируют наличие в образце триптофана и/или тирозина. При диагностировании триптофана и/или тирозина определяют контаминацию образца, а при отсутствии триптофана и тирозина - отсутствие контаминации.

Наличие в образце триптофана и/или тирозина свидетельствует о наличии в образце микробов и/или остатков их метаболитов. Таким образом, при обнаружении триптофана и/или тирозина можно сделать вывод о микробной контаминации образца БЦ, а при отсутствии триптофана и тирозина - об отсутствии микробной контаминации. При определении контаминации продолжают очистку образца БЦ и контроль его контаминации до полной очистки.

Экспериментально установлено, что при облучении менее 193 нм ответная флюоресценция триптофана и/или тирозина будет снижена, что не позволит достоверно диагностировать контаминацию образца.

Использование излучения с длиной волны больше 310 нм также приводит к снижению ответной флюоресценции триптофана и/или тирозина и не позволит достоверно диагностировать контаминацию образца.

Предлагаемое изобретение поясняется фиг. 1, на которой представлен снимок микробной контаминация нативной бактериальной целлюлозы (БЦ) с высокой плотностью бактерий-продуцентов, по окончанию синтеза после отмывки дистиллированной водой, аутофлюоресценция, объектив х40. На фиг. 2 представлены примеры нормированных спектров флюоресценции БЦ. (1) - нативная гель-пленка БЦ, где доминирует спектр триптофана (λem) 321-350 нм, пик флюоресценции (λem) 324 нм, возбуждение (λех) 280 нм. (2) - гель-пленка БЦ после обработки NaOH, где доминирует спектр тирозина (λem) 295-299 нм, пик флюоресценции 309 нм, возбуждение (λех) 280 нм.

Промышленная применимость предлагаемого способа подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Образец БЦ 1×1 см поместили под источник облучения - NdYAG лазер с оптопараметрическим преобразователем с длиной волны излучения (λех) 280 нм. Ответную флюоресценцию регистрировали спектрометром в диапазоне (λem) 290-800 нм. В спектре ответной флюоресценции был зарегистрирован максимум вторичной флюоресценции на длине волны (λеm) 324 нм, что свидетельствует о наличии в образце флюоресценции триптофана, что однозначно диагностирует микробную контаминацию образца. Пример получаемого результата представлен на фиг. 2.

Пример 2

Образец БЦ 1×1 см поместили под источник облучения - NdYAG лазер с оптопараметрическим преобразователем с длиной волны излучения (λех) 280 нм. Ответную флюоресценцию регистрировали спектрометром в диапазоне (λem) 290-800 нм. В спектре ответной флюоресценции был зарегистрирован максимум вторичной флюоресценции на длине волны (λem) 309 нм, что свидетельствует о наличии в образце флюоресценции тирозина и/или триптофана, что однозначно диагностирует микробную контаминацию образца. Пример получаемого результата представлен на фиг. 2.

Пример 3

Образец БЦ 0,5×1 см облучили источником ультрафиолетового излучения, источник излучения - ртутная лампа с полосовым оптическим фильтром, выделяющим линию с длиной волны (λex) 254 нм. Регистрация - спектрометр, измеряющий в диапазоне длин волн (λem) 290-600 нм, зарегистрирована ответная флюоресценция в области (λem) 300-350 нм, что свидетельствует о наличии в образце триптофана (300-350 рм) и/или тирозина, поскольку в области 300-320 нм возможна флюоресценция как тирозина, так и триптофана. Диагностировали контаминацию образца.

Пример 4

Образец БЦ 5×5 см облучили источником ультрафиолетового излучения. Источник облучения - светодиод с максимумом излучения на длине волны (λех) 275 нм. Регистрация - цифровая камера, чувствительная в спектральном диапазоне (λem) 300-350 нм, с полосовым оптическим фильтром на диапазон (λem) 295-350 нм. Зарегистрирована флюоресценцию в области 295-350 нм, что свидетельствует о наличии в образце триптофана и/или тирозина, что однозначно диагностирует микробную контаминацию образца.

Пример 5

Образец БЦ 0,2×0,3 см облучили источником ультрафиолетового излучения. Источник облучения - NdYAG лазер с преобразованием 4й гармоники с длиной волны излучения (λех) 266 нм. Регистрация - фотодиод с полосовым оптическим фильтром на диапазон (λem) 295-350 нм. Зарегистрирована флюоресценция в области 295-350 нм, что свидетельствует о наличии в образце триптофана и/или тирозина, что однозначно диагностирует микробную контаминацию образца.

Пример 6

Образец БЦ 2×2 см облучили источником ультрафиолетового излучения - ArF эксимерным лазером с длиной волны (λех) 193 нм. Регистрация - спектрометр, измеряющий в диапазоне длин волн (λem) 290-600 нм. Зарегистрирована флюоресценция в области (λem) 300-350 нм, что свидетельствует о наличии в образце триптофана (300-350 нм) и, возможно, тирозина, поскольку в области 300-320 нм возможно наличие как триптофана, так и тирозина, что однозначно диагностирует микробную контаминацию образца.

Пример 7

Образец БЦ 2×2 см облучили источником ультрафиолетового излучения - светодиодом с длиной волны (λех) 310 нм. Регистрация - спектрометр, измеряющий в диапазоне длин волн (λem) 310-600 нм. Зарегистрирована флюоресценция в области (λem) 321-350 нм, что свидетельствует о наличии в образце триптофана и однозначно диагностирует микробную контаминацию образца.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения микробной контаминации целлюлозы бактериального происхождения (БЦ), включающий облучение образца БЦ источником ультрафиолетового излучения с длиной волны λех 193-310 нм, затем при регистрации ответной флюоресценции, исходящей от образца в спектральной полосе λem 321-350 нм, диагностируют наличие в образце триптофана, при регистрации ответного излучения в спектральной полосе λem 295-299 нм диагностируют наличие в образце тирозина, при регистрации ответного излучения в спектральной полосе λem 300-320 нм диагностируют наличие в образце триптофана и/или тирозина, при диагностировании триптофана и/или тирозина определяют контаминацию образца, а при отсутствии триптофана и тирозина - отсутствие контаминации. Способ обеспечивает повышение точности определения микробной контаминации бактериальной целлюлозы. 2 ил., 7 пр.

Способ определения микробной контаминации целлюлозы бактериального происхождения (БЦ), включающий облучение образца БЦ источником ультрафиолетового излучения с длиной волны λех 193-310 нм, затем при регистрации ответной флюоресценции, исходящей от образца в спектральной полосе λem 321-350 нм, диагностируют наличие в образце триптофана, при регистрации ответного излучения в спектральной полосе λem 295-299 нм диагностируют наличие в образце тирозина, при регистрации ответного излучения в спектральной полосе λem 300-320 нм диагностируют наличие в образце триптофана и/или тирозина, при диагностировании триптофана и/или тирозина определяют контаминацию образца, а при отсутствии триптофана и тирозина - отсутствие контаминации.