Способ количественного определения истинного белка в кормовых дрожжах Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

со

00

Изобретение относится к исследованию и анализу материалов, в частности к определению содержания белка в кормовых дрожжах гидролизных производств или в белково-витаминных концентратах, и может быть использовано для автоматического контроля продукции гидролизно-дрожжевых заводов и заводов БВК микробиологической промышленности.

Цель изобретения - повышение достоверности и сокраш.ение времени определения. 10

Способ заключается в том, что сначала отделяют белок от других компонентов путем осаждения его сульфатом меди в ш,елочной среде, а затем после отделения осадка его растворяют в щелочном растворе комплексона III при нагревании. Далее раствор разбавляют дистиллированной водой в 125 раз. К аликвотной части анализируемого раствора добавляют реактив Фолина с целью получения окрашенного комплекса (реакция Лоури). Полученный окрашен- 20 ный раствор фотометрируют, используя светофильтр, пропускаюш,ий длины волн около 700 нм. Содержание белка рассчитывают с помош,ью предварительно построенного по стандартным растворам альбумина градуи- ровочного графика или путем сравнитель- ного измерения со стандартом.

Продолжительность измерений по предлагаемому способу в 4 раза короче, чем по известному.

15

рованной водой до нормальности, равной единице (раствор Е).

Раствор А приготавливают, растворяя 2 г углекислого натрия в 100 см 0,1 и. водного раствора едкого натра.

Для приготовления раствора В сначала растворяют 10 г винно-кислого натрия-калия в 300 см дистиллированной воды. Добавляют туда 5 г сернокислой меди (CuSO4 5Н20) и после растворения соли доводят объем до 1 л дистиллированной водой.

Раствор С приготавливают, смешивая 49 см раствора А и I см раствора В. Обычно полученный раствор используют в течение суток.

Указанные растворы используют для выполнения фотометрических определений как с исследуемым раствором белка, так и со стандартными растворами альбумина, приготовленными для построения градуировочного графика. Этот график зависимости оптической плотности окрашенного раствора (после проведения реакции Лоури) от содержания в нем альбумина строят всякий раз, когда заново приготавливается реактив Фолина. Следовательно, таким градуировочным графиком можно пользоваться в течение года.

Непосредственно перед выполнением анализов готовят 12%-ный раствор CuSO4X 5 Н20; 2,5%-ный и 1 н. растворы

Ускоренный перевод белка в раствор в ,р гидрооксида натрия, а также 0,25 М раствор

предлагаемом способе достигается путем обработки осадка медно-белкового комплекса 0,25 М водным раствором комплексона III и последующим тридцатиминутным кипячении анализируемой смеси в 1 н. щелочи. Высокая селективность предлагаемого способа определения истинного белка связана прежде всего с.использованием высокочувствительной и специфической реакции Лоури, а также с предварительным отделением значительной части мешающих примесей на

30

35

комплексона III. Эти растворы могут быть приготовлены заранее и использованы многократно.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут точную навеску средней пробы дрожжей массой около 0,4 г, помещают ее в стакан вместимостью 200 см, добавляют 50 см доведенной до кипения дистиллированной воды, 10 см 12%-ного раствора сернокислой меди и по каплям

стадии осаждения медно-белкового комплек- 40 при перемещивании 10 см 2,5%-ного раствора гидрооксида натрия. Полученному осадку дают отстояться и фильтруют его через бумажный фильтр. Осадок промывают двумя порциями (по 20 см) дистиллированной

са.

В отличие от други --- фотометрических реакций на белок, реакция Лоури настолько чувствительна, что позволяет повысить селективность метода путем разведения анализируемого раствора до предельных концентраций интерферирующих примесей.

Предлагаемый способ определения белка в кормовых дрожжах осуществляют следующим образом.

Приготавливают все необходимые реактивы и растворы.

Реактив Фолина приготавливают по известным методикам (реактив Фолина можно хранить в темной закрытой склянке в течение 1 года). Перед использованием реактива Фолина устанавливают его нормальность путем титрования стандартным раствором щелочи, а затем разбавляют его дистилли45

воды. Фильтрование и промывание осадка

осуществляют декантацией, после чего фильтр с осадком возвращают в тот же стакан. К осадку добавляют при перемещивании 20 см 0,25 М раствора комплексона III и 60 см I н. раствора едкого

5Q натра. Содержимое стакана нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане, периодически перемешивая раствор стеклянной палочкой. Затем раствор переносят в мерную колбу на 500 см, оставляя фильтр в стакане. При этом фильтр и стенки

55 стакана промывают небольшими порциями горячей воды, сливая все промывные воды в мерную колбу с анализируемым раствором. Содержимое колбы охлаждают до комнатной

0

0

5

рованной водой до нормальности, равной единице (раствор Е).

Раствор А приготавливают, растворяя 2 г углекислого натрия в 100 см 0,1 и. водного раствора едкого натра.

Для приготовления раствора В сначала растворяют 10 г винно-кислого натрия-калия в 300 см дистиллированной воды. Добавляют туда 5 г сернокислой меди (CuSO4 5Н20) и после растворения соли доводят объем до 1 л дистиллированной водой.

Раствор С приготавливают, смешивая 49 см раствора А и I см раствора В. Обычно полученный раствор используют в течение суток.

Указанные растворы используют для выполнения фотометрических определений как с исследуемым раствором белка, так и со стандартными растворами альбумина, приготовленными для построения градуировочного графика. Этот график зависимости оптической плотности окрашенного раствора (после проведения реакции Лоури) от содержания в нем альбумина строят всякий раз, когда заново приготавливается реактив Фолина. Следовательно, таким градуировочным графиком можно пользоваться в течение года.

Непосредственно перед выполнением анализов готовят 12%-ный раствор CuSO4X 5 Н20; 2,5%-ный и 1 н. растворы

гидрооксида натрия, а также 0,25 М раствор

комплексона III. Эти растворы могут быть приготовлены заранее и использованы многократно.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут точную навеску средней пробы дрожжей массой около 0,4 г, помещают ее в стакан вместимостью 200 см, добавляют 50 см доведенной до кипения дистиллированной воды, 10 см 12%-ного раствора сернокислой меди и по каплям

при перемещивании 10 см 2,5%-ного раствора гидрооксида натрия. Полученному осадку дают отстояться и фильтруют его через бумажный фильтр. Осадок промывают двумя порциями (по 20 см) дистиллированной

ри перемещивании 10 см 2,5%-ного раствора гидрооксида натрия. Полученному осадку дают отстояться и фильтруют его через бумажный фильтр. Осадок промывают двумя порциями (по 20 см) дистиллированной

воды. Фильтрование и промывание осадка

осуществляют декантацией, после чего фильтр с осадком возвращают в тот же стакан. К осадку добавляют при перемещивании 20 см 0,25 М раствора комплексона III и 60 см I н. раствора едкого

натра. Содержимое стакана нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане, периодически перемешивая раствор стеклянной палочкой. Затем раствор переносят в мерную колбу на 500 см, оставляя фильтр в стакане. При этом фильтр и стенки

стакана промывают небольшими порциями горячей воды, сливая все промывные воды в мерную колбу с анализируемым раствором. Содержимое колбы охлаждают до комнатной

температуры под струей воды, раствор в колбе доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. 100 см полученного раствора переносят в мерную колбу на 250 см, доводят раствор до метки водой и перемешивают. С целью отделения взвешенных частиц из раствора берут около 20 см анализируемого вещества, фильтруют раствор в сухой стаканчик через фильтр с синей лентой, отбрасывая первую порцию фильтрата. Затем с помошью пипетки отбирают 5 см фильтрата, помещают его в мерную колбу на 25 см , добавляя туда 15 см раствора С и осторожно перемешивают в течение 10 мин. После этого добавляют 1,5 см раствора Е, доводят содержимое до метки дистиллированной водой и перемешивают, после чего оставляют стоять 30 мин. Полученный раствор синего цвета фотометрируют в кювете толщиной 1 см при длине волны .690 им на фотоколориметре, пользуясь красным светофильтром. В качестве нулевого раствора обычно используют раствор «холостого опыта, который получают по описанной методике, заменив анализируемый раствор белка (5 см ) соответствующим количеством дистиллированной воды. Оптическая плотность анализируемого раствора измеряется три раза. За истинный результат принимают среднее арифметическое трех параллельных измерений. По величине оптической плотности, пользуясь градуировочным графиком, рассчитывают количество белка в аликвотной части анализируемого (у, мкг), а затем массовую долю истинного белка в кормовых дрожжах по формуле, %:

временно анализ трех параллельных проб, а за истинный результат принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных определений.

Общая продолжительность измерения массовой доли истинного белка в кормовых дрожжах составляет 2-2,5 ч.

В табл. 1 приведены в. качестве примера результаты определений содержания белка по предлагаемому способу в кормовых дрожжах гидролизно-дрожжевых заводов.

Таблица 1

Контроли- руемое предприятие

Найдено истинного белка (средний результат серии анализов), %

Астраханский ГДЗ

- ВолжскийГДЗ

Кировский БХЗ

47,55 45,37 49,12

30,71 30,20

34,04

Изобретение относится к определению содержания истинного белка в кормовых дрожжах гидролизных производств или бел- ково-витаминных производств или в бел- ково-витаминных концентратах. Цель изобретения - повышение достоверности и со- краш,ение времени. Способ заключается в том, что белок в кормовых дрожжах осаждают сульфатом меди в шелочной среде, отделяют осадок и растворяют при нагревании в шелочном растворе комплексона III. К полученному раствору после разбавления его водой добавляют реактив Фо- лина и осуществляют фотоколориметрическое определение содержания белка в анализируемой пробе, используя в качестве стандарта раствор альбумина. 3 табл. I сл

Б

у 0,025

еу

-()

количество белка в аликвотной части раствора, найденное по градуировочному графику, мкг;

0,025 - коэффициент, учитывающий разбавление, соотношение размерностей и т. д.;

а - масса анализируемой навески дрожжей, г;

W - массовая доля влаги в кормовых дрожжах, %.

При необходимости получения более точх результатов анализа проводят одно

В табл. 2 дана сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов измерения массовой доли белка в кормовых дрожжах.

Для сравнения предлагаемого способа со способом Бернштейна готовят модельные

смеси из белка и нуклеиновых кислот. Так как нет надежного способа выделения чистого белка из кормовых дрожжей, модельную смесь готовят из альбумина и ДНК, причем альбумин берут в количестве, отвечаюшем среднему содержанию белка в

навеске 0,4 г кормовых дрожжей, а ДНК-13% от содержания альбумина. Результаты измерения белка приведены в табл. 1 (средние из 3-х определений)

Таблица 2

: В состав кормовых дрожжей, кроме ДНК, входить и другие нуклеотиды. Для большего приближения модельных смесей к I составу кормовых дрожжей экстрагируют ил них все компоненты, кроме белка, путем обработки навески дрожжей 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты. Содер- ж|ание нуклеиновых кислот в экстракте о|:ределяют по методу Спирина. В получен0,2114

0,0621

0,2089 (-1,18%) 0,244 (+15,49%)

н

Таким образом, при использовании пред- л гаемого способа осаждаемые солями меди (белковые азотсодержащие соединения (нуклеиновые кислоты) искажают результаты измерения истинного белка в кормовых д|зожжах в пределах погрешности из- рений, а по способу Бернштейна зна- 1тельно завышают результаты, измерения ;тинного белка.

Формула изобретения

Способ количественного определения истинного белка в кормовых дрожжах, преном экстракте содержатся нуклеиновые кислоты в количестве 1,24 мг в см. Модельные смеси готовят из навески альбумина, к которой добавляют 50 см экстракта из кормовых дрожжей. Раствор нейтрализуют до рН 7 и дадее операции проводят по предлагаемому способу и по способу Берн- штейна. Результаты измерений (средние из 3-х определений) приведены в табл. 3.

Таблица 3

дусматриваюш,ий осаждение его сульфатом меди в ш,елочной среде, отделение осадка с последуюш,ей оценкой результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения достоверности и сокращения времени определения, после отделения осадка осуществляют солюбилизацию белка путем выделения его в медно-белковый комплекс и разрушения его при нагревании в течение 30 мин на водяной бане в 0,25 М растворе комплексона III с последующим разбавлением раствора дистиллированной водой, а оценку результатов осуществляют спектрофотометрически.