Способ селекционной диагностики зерна кукурузы на наличие гена Опейк-2 Советский патент 1991 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционно-генетическим исследованиям сельскохозяйственных культур, и может быть широко применено при массовой оценке селекционного материала на наличие гена Опейк-2.

Целью изобретения является повышение точности и достоверности диагностики, упрощение и удешевление анализов.

Способ состоит в том, что диагностику ведут по одному сортообразцу, при этом зерно кукурузы идентифицируют по соотношению удельной активности ингибитора трипсина к удельной активности ингибитора химотрипсина и при соотношении удельных активностей до 4-5 тестируют исходную линию, а при соотношении более 5 - мутантную форму с наличием гена Опейк-2.

В табл, 1 представлен состав смесей реагентов при построении калибровочного графика определения белка по Лоури, в табл. 2 - соотношение удельных активностей ингибиторов трипсина и химотрипсина в зерне исходных и му- тантных форм кукурузы, в табл. 3 - характеристика анализа соотношения удельных активностей - удельной активности ингибитора трипсина к удельной активности ингибитора химотрипсина для случая, когда показатели затрудняют идентификацию, в табл. 4 - выявление наличия гена Опейк-2 в одном сортообразце при отсутствии исходных аналогов.

На чертеже изображен калибровочный график определения белка по Лоури с предварительным осаждением бычьего сывороточного альбумина.

Способ осуществляют следующим образом.

Для выполнения работы предварительно подготавливают реактивы и строят ка- с либровочные кривые.

1. Раствор химотрипсина с концентрацией 15 мкт/мл (3 мг фермента растворяют в 10 мл бидистиллированной

В пробирках смешивают 0,2 мл водного экстракта зерна кукурузы 1:20 с 0,3 мл буфера 3, для определения ак- тивности ингибитора химотрипсина берут 0,4 мл экстракта и 0,1 мл буфера, прибавляют 0,5 мл раствора фермента и выдерживают при комнатной температуре 10 мин, затем прибавляют 1 мл расводы), затем перед определением раст-Q твора казеина, инкубируют при 35°С на

водяной бане 20 мин и останавливают реакцию, прибавляя 3 мл 5%-ной три- хлоруксусной кислоты.

вор разбавляют в 16 раз и спектрофо- тометрически определяют концентрацию фермента по формуле

(м1/мл),

где Е - коэффициент молярной экстинк- цин, равный для химотрипсина 0,50; Д„ - поглощение раствора фермента

при 280 нм,

2, Раствор трипсина концентрацией 25-30 мкг/мп (7,5 мг перекристаллизованного трипсина растворяют в смеси 10 мл 0,001 н НС1 к 15 мл бидистил- лированной воды рН 4,5).

1

В пробирках смешивают 0,2 мл водного экстракта зерна кукурузы 1:20 с 0,3 мл буфера 3, для определения ак- тивности ингибитора химотрипсина берут 0,4 мл экстракта и 0,1 мл буфера, прибавляют 0,5 мл раствора фермента и выдерживают при комнатной температуре 10 мин, затем прибавляют 1 мл раствора казеина, инкубируют при 35°С на

водяной бане 20 мин и останавливают реакцию, прибавляя 3 мл 5%-ной три- хлоруксусной кислоты.

Для каждой пробы готовят соответ- струющую нулевую пробу: прибавляют реагенты аналогично описанному, вводя раствор трихлоруксусной кислоты перед раствором казеина.

Контроль фермента: к 0,5 мл буфе- ра прибавляют 0,5 мл раствора фермента, затем 1 мл раствора казеина и после инкубации при 35° С в течение 20 мин - 3 мл 5%-ной ТХУ. Пробы оставляют при комнатной температуре на 30 мин для более полного формирова-

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционно- генетическим исследованиям кукурузы, и касается выявления онановых форм. Целью изобретения является повышение точности и достоверности диагностики, упрощение и удешевление анализа. Способ состоит в том, что наличие гена Опейк-2, определяют по отношению удельной активности ингибитора трипсина к удельной активности ингибитора химотрипсина и при его значении до 4-5 идентифицируют исходную форму9 а при отношении свыше 5 - опаловую. 4 табл., 1 ил.

Для приготовления исходного раствора при определении ингибиторной активности и построении калибровочной кривой раствор фермента разбавляют в 7 раз бидистиллированной водой непос- JQ троль фермента измеряют против его редственно при определении. Концентра- нулевой пробы, цию фермента определяют по формуле

ния осадка, затем осадок отфильтро вают через сетчатый фильтр и измеря поглощение раствора против соответ вующей нулевой пробы при 280 нм. К

Содержание ингибитора рассчитыв ют пр фор мул е

С ЕхДгйо (мг/мл),

где Е - коэффициент молярной экстинк- ции, равный для трипсина 0,65;

Д-. - поглощение раствора фермента при 280 нм.

в 250 мл, 0,1 М фосфатного буфера рН 7,7) оставляют на 2 ч в холодильнике набухать. Затем нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин при по- мешивании. После охлаждения раствор фильтруют,

и 0,2227 г КН2Р04).

К равным навескам муки 0,5-1 г образцов зерна кукурузы прибавляют воду в соотношении 1:20 и выдерживают при 0-20°С при помешивании 2 ч, центрифугируют 10-15 мин при 2000-3000 об/мин и супернатант отделяют от осадка.

троль фермента измеряют против его нулевой пробы,

ния осадка, затем осадок отфильтровывают через сетчатый фильтр и измеряют поглощение раствора против соответствующей нулевой пробы при 280 нм. Кон-

троль фермента измеряют против его нулевой пробы,

0

5

С

5

Содержание ингибитора рассчитывают пр фор мул е

СхЕогт пчп (

ь рерМ

где И - ингибиторная активность, мг

фермента/1 г муки; С - концентрация исходного раствора фермента, мг/мл; Е - разность между экстинкциями контроля фермента и опытной пробой, измеренная против соответствующих нулевых проб; - зкстинкция контроля фермента; разведение исходного экстракта ингибитора по отношению к объему фермента ( мл фермента/У hci экстракта); первоначальное разведение ис- ходного экстракта (в данном случае оно равно 21).

Удельную активность ингибиторов рассчитывают по формуле

ум- И мг ферм, /г муки

С г белка/г муки

где УИ - удельная .активность, мг фермента/1 г белка;

ферм

п

m С - содержание белка по Лоури, г/г муки.

Метод определения содержания белка по. Лоури основан на образовании окрашенных ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биурето- вой реакцией на пептидные связи. Высокая чувствительность метода дает возможность определять 10-100 мкг белка в пробе.

Существует много модификаций метода Лоури, позволяющих устранить влияние некоторых небелковых компонентов среды на развитие окраски. В случае определения содержания белка в зерне кукурузы целесообразно предварительное осаждение белка из растворов, например, трихлоруксусной кислотой с последующим растворением их в щелочных растворах.

Реактивы:

Для построения калибровочной кривой предварительно осаждают белок, К 16,7 мл 10% CClgCOOH приливают 25 мл бычьего сывороточного альбумина, тщательно перемешивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Выпавший мелкодисперсный осадок белка отделяют центрифугиро- ваннем в течение 30 мин при 13,5 тыс. об. / 1 /мин и промывают 2%- ным раствором CCliCOOH. Раствор центрифугируют при тех же условиях. Супернатант слива- ют, а к осадку добавляют 2 ми 1 н раствора щелочи и осторожно перемешивают до полного растворения осадка. Раствор белка количественно переносят в мерную колбу на 25 мл, доводят

5 до метки водой, тщательно перемешивают и проводят определение белка.

Путем разведения готовят рабочие растворы сывороточного альбумина концентрациями 10-100 мкг, помещают в

пробирки, приливают в каждую 2 мл рабочего раствора 3, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина-Чокап ьтеу , содержимое проби-

5 рок тщательно перемешивают и через 30 мин колорнметрируют при 750 нм. Полученные результаты используют для построения калибровочного графика. При определении содержания белка

0 в зерне кукурузы используют водный раствор альбуминовой фракцчи и соблюдают те же условия, что и при построении калибровочного графика. Объем раствора берут 0,4 мл, содержащий 10-

c 100 мг белка, предварительно осажденного трихлоруксусной кислотой. По калибровочному графику определяют содержание белка в опытной пробе.

Пример 1. Предложенным спосо-

0 бом проводят анализ удельной активности ингибиторов трипсина и химотрипси- на и определяют их соотношетше в зрелом зерне исходных А 204 + + +, Wf 9 +++, W 64 А +++ и мутантных А 204

5 о202.02 wf 9 Ог°г°г W 6 А °2°г-ог линий кукурузы. У всех мутантных форм

кукурузы соотношение удельной активности трипсина к удельной активности химотрипсина (УАТр/УАчтр) сое-

0 тавляет 6,6-34,7, а у исходных - 1,0- 5,0. Данная закономерность свидетель- ствует, что у опсйковых форм кукурузы соотношение удельных активностей двух ингибиторов протеиназ выше 5,0,

5 а у исходных менее 4-5 сохраняется во все годы исследования.

П р и м е р 2. Характеристика анализа соотношения удельных активностей ингибиторов протеиназ при граничных

(стопорных) значениях коэффициента По 1 г муки кукурузы двух линий W 155 исходной и мутантной урожая, 1984 г. исследуют предложенным способом. Для этого образцы заливают 20 мл бидистиллированной воды и проводят экстракцию альбуминов в течение 2 ч при комнатной температуре. В супер- натайте определяют удельную активность ингибиторов трипсина, химо- трипсина и их соотношение. По результатам анализов обнаружено (табл. 3,

1984г,), что наличие у одного из образцов значения соотношения 5,0 не дает возможности четко идентифицировать образец и причислить его или к исходной, или к мутантной форме кукурузы. Поэтому анализ повторяют для тех же линий из репродукции последующих

1985и 1986 гг. Средние значения соотношения за три года наглядно сви- детельсвуют о необходимости причислить спорный образец к исходной линии без наличия гена Опейк-2. У опей- ковой формы кукурузы соотношение удельных активностей ингибиторов за три года составляет 15,3-27,8, а у исходной - лишь 2,3-5,0,

Пример 3. Выявление гена Опейк-2 в одном сортообразце при отсутствии исходных аналогов. По 0,5 i муки кукурузы трех гибридных образцов кукурузы m К 3 S и 2; Сг2о Wx и Км 212 заливают по 10 мл бидис- тиллированной воды и проводят экстракцию альбуминов в течение 2 ч при комнатной температуре, В супер-

Состав смесей реагентов при построении калибровочного графика определения белка по Лоури

5

0

5

натайте определяют соотношение удельных активностей ингибиторов трипсина и химотринсина.

Данный пример свидетельствует о том, что высокие значения соотношений удельных активностей ингибиторов получены для зерна гибридов, содержащих в своем генотипе ген Опейк-2, а низкое содержание соотношения 4,3 характерно для гибрида, не содержащего этот ген и позволяет выявлять ген Опейк-2 при анализе одного сор- тообразца или при отсутствии исходных аналогов.

Формула изобретения

Способ селекционной диагностики зерна кукурузы на наличие гена Опейк-2, включающий спектральный анализ активности ингибитора химотрипси- на в альбуминовой фракции экстракта белков и последующее выявление опаковых линий, отл ичающийся тем, что, с целью повышения точности и достоверности диагностики, упрощения и удешевления анализов, диагностику ведут по одному сортообразцу, при этом определяют удельную активность ингибитора трипсина и наличие гена Опейк-2 устанавливают пр соотношению удельной активности ингибитора трипсина к удельной активности ингибитора химотрипсина и при их соотношении до 4-5 идентифицируют исходную форму, а при соотношении более 5 - опаковую линию.

Таблица 1

Таблица 2 Результаты исследования исходных и мутантных линий

Таблица 3 Исследования генотипа с соотношением, близким к 5

Таблица 4 Выявление гена Опейк -2 в одном сортообразце при отсутствии исходных аналогов

Тип кукурузы

тК 3 CfcOjO S и 2

Cr2o2W

Км 212

УА инг,трипе/

/УА инг, химотрипс.

87,3

13,8

4,3

%С

0.4

0.3

0,2

ОД

10 20 30 40 50 80 70 80 90 100

:лкг белка