СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗНОЙ АГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ К99 СЫВОРОТКИ Советский патент 1995 года по МПК A61K39/108 C12N1/00 C12N1/00 C12R1/19 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано при получении агглютинирующих сывороток для диагностики колибактериоза телят, а также для идентификации антигена К99 у производственных штаммов эшерихий и его содержания в вакцинных препаратах.

Целью изобретения является упрощение способа, а также повышение активности, и специфичности целевого продукта.

Для получения сыворотки, содержащей антитела для К99 антигена иммунизацию кроликов ведут нативными клетками штамма Escherichia coli PCI.

Штамм E. coli PCI представляет собой моноплазмидный вариант культуры E. coli C600 (p K 99, thr, leu, B₁, lac^-, tet^r, str^r, Nal^r, полученный путем скрещивания штамма E.coli 1407 (0101:K99:H) с реципиентом E.coli C600.

Синтез антигена К99, а также устойчивость штамма PCI к тетрациклину, стрептомицину детерминируются генами, локализованными на конъюгативной плазмиде с мол.м. 46 мегадальтон. Гены устойчивости к налидиксовой кислоте локализованы на хромосоме штамма С600. Плазмида К99 стабильно наследуется в штамме С600 при многократных пересевах в неселективных условиях на плотных и жидких питательных средах.

Штамм Escherichia coli PCI депонирован в коллекции микроорганизмов Всесоюзного государственного научно-контроль- ного института ветеринарных препаратов под номером 422-16/37 и характеризуется следующими свойствами.

Культуральные, морфологические и тинкториальные свойства.

Клетки штамма не окрашиваются по Граму (грамотрицательные), неподвижные, бескапсульные, в виде палочек с закругленными концами длиной 1-3 и толщиной 0,5-0,7 мкм. Хорошо растут на мясопептонном агаре и бульоне. Не растут на минимальной среде без добавления треонина, лейцина и тиамина. Через 15-16 ч культивирования на МПА вырастают слегка выпуклые бесцветные, средней величины (2-3 мм) округлые колонии с неровными краями (О-R-формы).

Ферментативные свойства.

Штамм сбраживает глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, рамнозу, ксилозу, сорбит. Не сбражиавет рафинозу, лактозу и дульцит. Образует индол и не образует сероводород. Дает положительную реакцию с метиловым красным, не образует ацетилметилкарбинол. Желатин не разжижает. Не продуцирует гемолизинов и колицинов. На среде Эндо вырастают лактозонегативные колонии.

Антигенные свойства.

Штамм находится в O-R-форме и при кипячении в изотоническом растворе хлорида натрия выпадает в осадок в виде хлопьев. При культивировании на полусинтетической среде Минка штамм образует антиген К99, других О-, К- и Н-антигенов, диагностически занчимых для Е.coli, штамм не синтезирует. Клетки штамма вызывают агглютинацию эритроцитов барана и морской свинки в присутствии 0,5-1%-ной Д-маннозы.

Вирулентные свойства.

ЛД₅₀ штамма для белых беспородных мышей массой 18-20 г составляет 2 ± 0,5 млрд. микробных клеток суточной агаровой культуры.

Штамм имеет развитый поверхностный антиген К99 и не содержит известных для эшерихий О-, К-, Н-антигенов.

П р и м е р 1. Для получения диагностической агглютинирующей К99 сыворотки штамм выращивают 24 ч при 37^оС на агаре Минка (в чашках Петри). После проверки на чистоту культуру смывают физиологическим раствором хлористого натрия и готовят микробную взвесь концентрацией 2 ± 0,5 млрд. м.т. Полученную взвесь бактерий используют для иммунизации кроликов живой массой 2,5-3,0 кг. Антиген вводят внутривенно в количестве 1 ± 0,5 млрд. мк.т. четырехкратно с промежутком между введением антигена 7 дн. Сыворотки, полученные через 8 дн. после последней иммунизации, консервируют азидом натрия (0,05 мг/мл) и проверяют на активность и специфичность в реакции агглютинации на стекле, используя в качестве референс-препарата адсорбированную К99 сыворотку. Положительная реакция, оцениваемая на три-четыре креста, характеризуется склеиванием клеток в зерна или хлопья различной величины и полным или частичным просветлением сыворотки при наличии гомогенной взвеси в контроле. Контролем служит испытуемая культура, смешанная с каплей физиологического раствора хлористого натрия.

Результаты проведенных испытаний, представленные в табл.1 и 2, свидетельствуют о возможности получения с помощью штамма PCI специфической и высокоактивной агглютинирующей сыворотки К99, не прибегая к ее адсорбции (неадсорбированная сыворотка).

П р и м е р 2. Обнаружение адгезивного антигена К99 у культур эшерихий, выделенных из патологического материала.

Культуры кишечной палочки, выделенные из патологического материала больных или павших животных, высевают на чашках Петри со средой Минка и культивируют 24 ч при 37^оС. Выросшие на среде Минка колонии испытывают в реакции агглютинации с неадсорбированной К99 сывороткой, разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:10. Реакцию считают положительной, если испытуемая культура в течение 1 мин агглютинируется разведенной 1:10 сывороткой, но не агглютинируется в физиологическом растворе.

Для обоснования схемы и дозы иммунизации с целью получения агглютинирующей К99 сыворотки три группы кроликов иммунизируют внутривенно различными дозами живых клеток штамма РСI, выращенного в течение 18 ч на среде Минка. Взвесь клеток вводят четырехкратно.

Результаты представлены в табл.3.

Из таблицы следует, что наибольшая активность сыворотки, определенная в реакции агглютинации на стекле с живой культурой штамма РСI, у кроликов, иммунизированных дозами по 10^.10⁸ с интервалом между инъекциями антигена 7 дн.

Используемый штамм Escherichia coli ВГНКИ N 422-16/37 PCI, созданный на основе штамма E.coli C600 не синтезирует известных 0-, К-, Н-антигенов, содержит природную плазмиду, которая детерминирует продукцию антигена К99 и придает клеткам штамма PCI устойчивость к тетрациклину и стрептомицину. Наличие у штамма антибиотических маркеров, сцепленных с признаком К99, позволяет селекционировать плазмидсодержащие клетки при работе со штаммом PCI в условиях производства. Низкая вирулентность штамма PCI позволяет использовать его для иммунизации кроликов без инактивирования.

Использование предлагаемого изобретения в практике ветеринарии позволяет усовершенствовать и упростить диагностику колибактериоза телят и ягнят.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано при получении агглютинирующих сывороток для диагностики колибактериоза телят, а также для идентификации антигена К99 у производственных штаммов эшерихий и его содержания в вакцинных препаратах. Целью изобретения является упрощение способа, а также повышение активности и специфичности целевого продукта. Для получения сыворотки иммунизацию кроликов ведут нативными клетками штамма Escherichia coli ВГНКИ N 422-16/37. Штамм представляет собой моноплазмидный вариант культуры E. coli С600 (рК99). Штамм не синтезирует известных 0-, К-, Н-антигенов. Содержит природную плазмиду, которая детерминирует продукцию антигена К99 и придает клеткам штамма устойчивость к тетрациклину и стрептомицину. Иммунизируют кроликов в дозе 1 ± 0,5 млрд.клеток внутривенно четырехкратно. Интервал между инъекциями 7 дн. Полученную сыворотку не адсорбируют. Полученная сыворотка высокоактивна и специфична. 3 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗНОЙ АГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ К99 СЫВОРОТКИ, включающий приготовление антигена из штамма Escherichia coli, иммунизацию продуцентов, взятие крови с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения активности и специфичности сыворотки, в качестве штамма используют моноплазмидный штамм Escherichia coli ВГНКИ N 422-16/37, а иммунизацию продуцентов проводят в дозе 0,5 1,5 млрд клеток четырехкратно с интервалом между инъекциями 7 дней.