ШТАММ ESCHERICHIA COLI Б-5, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕРМОЛАБИЛЬНОГО ЭКЗОТОКСИНА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A61K39/108 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, и может быть использовано для получения антигенов, применяемых при приготовлении диагностических и иммуногенных препаратов против колибактериоза сельскохозяйственных животных.

Колибактериоз (эшерихиоз) - инфекционная болезнь, вызываемая энтеропатогенными эшерихиями, - широко распространен во многих странах мира и наносит значительный экономический ущерб животноводству за счет высокой смертности телят и поросят.

Известно, что энтеропатогенные эшерихии обладают комплексом факторов вирулентности, из которых основными можно считать продуцирование термолабильных и термостабильных токсинов.

Известен штамм Escherichia coli ВГНКИ №422-16/37 (см. а.с. СССР №1412069, по кл. C 12 N 1/00, А 61 К 39/108, опубл. 27.10.95), представляющий собой моноплазмидный вариант культуры Е.coli С600 (рК99). Штамм содержит природную плазмиду, которая детерминирует продукцию антигена К99. Штамм используют для получения агглютинирующих сывороток для диагностики колибактериоза телят.

Однако данный штамм обладает выраженными вирулентными свойствами (вирулентные свойства данного штамма), что не позволяет его эффективно использовать для повышения резистентности сельскохозяйственных животных.

Известен также штамм Escherichia coli 234 - продуцент термолабильного энтеротоксина (см. заявку №94018861, по кл. C 12 N 1/20, опубл. 10.03.96). Штамм используют как антиген для иммунологической диагностики колиинфекций.

Однако данный штамм применяется только в медицинской практике и не используется при колибактериозах сельскохозяйственных животных.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Escherichia coli №305-37/12, продуцирующий термолабильный энтеротоксин (см. патент РФ №1149466, по кл. А 61 К 39/108, опубл. 10.12.95). Штамм имеет величину ЛД₅₀ для мышей, равную 57 млн.

Однако вирулентные свойства данного штамма достаточно высоки, что не позволяет его эффективно использовать для повышения резистентности животных.

Изобретение направлено на решение задачи создания апатогенного штамма Escherichia coli Б-5, продуцирующего только термолабильный токсин, обладающий иммуногенными свойствами.

Штамм выделен из селезенки павшего поросенка 10-дневного возраста, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ФГУ ВГНКИ), хранится в Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции (НИВС).

Штамм Escherichia coli Б-5 характеризуется следующими признаками.

Культуральные и морфологические признаки.

Культивирование осуществляют вначале на мясопептонном бульоне (МПБ), затем на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 37°С в течение от 18 до 48 часов при аэробных условиях. При этом на МПБ колонии растут диффузно, образуя интенсивную муть и легко разбивающийся осадок, на МПА вначале образуются гладкие, выпуклые, блестящие с ровными краями колонии S-формы. В последующем возможно образование переходных от S- к R-форме колоний и суховатых с неровными краями R-форм колоний (до 50%). На агаре Эндо формируются темно-красные с металлическим блеском колонии.

Ферментативные свойства.

Микроорганизм обладает подвижностью, проявляет каталазную активность, дает положительную реакцию с метилротом, продуцирует индол, ферментирует глюкозу с газообразованием, а также лактозу, арабинозу, маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, дульцит.

Условия и состав сред для токсинообразования: бульон Хоттингера.

Антигенные свойства.

Продукт, синтезируемый штаммом Escherichia coli Б-5, - термолабильный экзотоксин, не подверженный нейтрализации поливалентной антитоксической сывороткой против колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных.

Молекулярно-генетическая особенность штамма - треки штамма как в S-, так и в R-формах имеют репликон размером около 0,3 кб, в данном репликоне имеется ген, кодирующий В-субъединицу термолабильного токсина (ЛТ), обуславливающий иммуногенную активность штамма. Структурные гены ЛТ дополнительно интегрированы и в хромосому микробной клетки. В клетках штамма имеется репликон, несущий генетическую информацию регуляторного свойства, необходимую для синтеза ЛТ-продукции. У штамма имеется в наличии иммуногенный эпитоп, но отсутствует репликон, ответственный за реактогенность эшерихий.

Чувствительность к антибиотикам (зона задержки роста в мм): полимиксин - 11, стрептомицин - 25, левомицетин - 25, рифампицин - 9, карбенициллин - 15; не чувствителен к: оксациллину, доксициклину, линкомицину, тетрациклину, олеандомицину, ампициллину, пенициллину.

Вирулентные свойства.

Внутрибрюшинное введение культуры штамма в концентрации 5·10⁸ м.к./ см³ и объеме 0,5 мл гибели белых мышей не вызывает. LД₅₀ - 1,2·10¹⁰ м.к./см³. Гибель белых мышей наступает в течение суток.

Определение энтеротоксигенных свойств штамма.

Для определения токсинообразования культивирование штамма проводили в питательном составе Mundeli в течение 20 часов. Полученную бульонную культуру разделяли на токсиносодержащий материал и бакмассу методом стерилизующей фильтрации. Культуральная жидкость, лишенная бактериального компонента, служила материалом, содержащим экзотоксин Е.coli.

Устойчивость к температуре определяли прогреванием токсиносодержащего материала в течение 10-минутного кипячения при 100°С и последующим его введением белым мышам.

Определение ТЛ-токсина проводили с использованием: прогретого токсиносодержащего материала, непрогретого и питательной среды Mundeli - в качестве отрицательного контроля.

Культивирование штамма можно осуществлять, например, на разработанной и запатентованной Саратовской НИВС (патент №2142505) питательной среде следующего состава, мас.%: аминокровин 5-20; пептон 0,6-1,5; хлористый аммоний 0,08-0,18; хлористый натрий 0,09-0,11; гидролизат казеина 9-20; питательная среда “ИГЛА” 52-61; дистиллированная вода - остальное. На данной среде культивирование осуществляют в течение 7 суток при температуре 37°С, затем суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочная жидкость являлась энтеротоксигенным материалом.

Пример.

Доказательства наличия термолабильного (ТЛ) токсина осуществляли на биологических моделях с помощью теста отека лап белых мышей. Тест основан на способности энтеротоксинов при их подкожном введении вызывать отек близлежащих тканей.

С опытным и контрольным материалом проведен “тест отека лап белых мышей”. Испытуемые материалы вводили в подушечку задней лапы в объеме 0,05 мл. В каждой группе было по 5 белых мышей (всего 15). Отек лап учитывали через 48 часов. После умерщвления лабораторных животных инъецированные конечности отсекали по голеностопному суставу и взвешивали на электронных весах. Вес отсеченной конечности у мышей, подвергнутых инъецированию нативным токсиносодержащим материалом, превысил массу ампутированных конечностей мышей, которым вводили термоинактивированный материал и стерильную питательную среду, на 78 мг. Проведенные исследования свидетельствуют о продуцировании Е.coli штаммом Б-5 термолабильного токсина.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Штамм Escherichia coli Б-5 продуцирует термолабильный токсин, обладающий иммуногенными свойствами, и является апатогенным.

Штамм Escherichia coli Б-5, депонированный во ВГНКИ ветеринарных препаратов и кормов под №Б-5 и используемый для получения термолабильного экзотоксина.