Питательная среда для выявления фимбриального антигена адгезии F-41 Советский патент 1992 года по МПК A61K39/02 C12N1/00 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано в ветеринарии для выявления белка адгезии F-41 у энтеротоксигенных эшерихий при диагностике колибактериоза молодняка- сельскохозяйственных животных.

Известны среды для выявления антигена F-41, содержащие баранью кровь. . Недостатком применяемых питательных сред с кровью для выращивания испытуемых эшерихий является то, что они не позволяют во многих случаях обнаружить фимбриальный антиген у заведомо F-41 позитивных эшерихий. Это связано с непостоянством состава применяемой крови и невозможностью контролировать ее состав. Кроме того, применяемые питательные среды с кровью делают невозможным обнаружение антигена F-41 у эшерихий, образующих на богатых средах А-капсуль- ный термостабильный.антиген. Последний

вызывает инагглютинабельность культуры специфической сывороткой.

Наиболее близкой к предлагаемой является среда Минка следующего состава, мае. %:

Глюкоза0,1

Гидролизат казеина

кислотный0,1

№2НРСм-2Н201,01

КН2РСМ .0,13

Дрожжевой экстракт0,1

Агар-агар1.5

Дистиллированная

водаОстальное.

рН

Микроэлементы, мг/л:

MgSC-4 6Н20

-6Н20

CaCl2

7,5

1

0,135

3

Указанную среду засевали F-41 позитивным штаммом E.coll ВГНКИ 397А/37-14,

инкубировали при 37°С 18ч. Клетки снимали с плотной среды и анализировали в РА и под электронным микроскопом. Культура агглютинировалась специфической сывороткой с оценкой (1), под электронным микроскопом фимбрий не обнаружили. Следовательно, недостатком данной среды является низкая надежность выявления антигена F-41 в РА и невозможность выявления антигена под электронным микроскопом.

Целью изобретения является повышение надежности выявления антигена F-41 у эшерихий.Поставленная цель достигается выращиванием эшерихий на питательной среде при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%:

Глюкоза0,04-0,05

Гидролизат казеина

кислотный0,25-0,30

Дрожжевой экстракт 0,005-0,01

N32HP04-2Н200-5-0,55

КН2Р04 0,07-0,08

Агар-агар1,2-2

Дистиллированная

водаОстальное

рН 7,9-8,1.

Количественное соотношение компонентов предлагаемой питательной среды и ее рН обеспечивают повышенный уровень синтеза белка F-41 и высокую надежность его выявления как в РА, так и морфологически, под электронным микроскопом. Питательную, среду приготавливают следующим образом.

Гидролизат казеина кислотный и дрожжевой экстракт взвешивают и растворяют в дистиллированной воде в концентрации 5%, доводят до рН 7,9-8,1 и стерилизуют автоклавированием при 1 атм 15 мин. Фосфатный буфер приготавливают в концентрированном виде из расчета Na2HPQ4 2Н20 40 г/к и К2НР04 5,6 г/л и доводят до рН 7,9-8,1, стерилизуют автоклавированием при 1 атм 15 мин. К 800 мл расплавленного стерильного раствора 1,5-2,5 агар-агара на дистиллированной, воде добавляют 140- 150 мл концентрированного фосфатного буфера, 45-55 мл 5%-ного раствора гидролизата казеина, 1 мл 5%-ного раствора дрожжевого экстракта, 1-1,2 мл 40%-но- гр раствора глюкозы. Питательную среду перемешивают и разливают в чашки Петрм. После подсушивания среды ее засевают клетками E.coli ВГНКИ 397А/37-14 (F-414) редкими штрихами - 4-5 штрихов во взаимно перпендикулярных направлениях на чашке диаметром 90 мм (при посеве газоном антиген F-41 не выявляется). Посевы инкубируют при 37°С ч. Выросшую культуру проверяют на уровень синтеза антигена F-41 в РА со специфической сывороткой и под электронным микроскопом.

Для постановки РА на чистом стекле смешивают бактериальную суспензию объ- емом 5-10 мкл, (1-5) -10 мкл/мл, с анти-F- 41 сывороткой в разведении 1:10 и проводят

0 учет:РА в рассеянном освещении на темном фоне.

Оценку результатов агглютинации проводят по следующей схеме: быстрая, в течение нескольких секунд, агглютинация

5 клеток с образованием хлопьев и полным просветлением, жидкости в промежутках между хлопьями - оценка (4), около 75% клеток слиплось - оценка 3), около 50% неслипшихся клеток -оценка (2j, замедлен0 н.ое, в течение минуты, образование хлопьев при слабом просветлении жидкости, около 25% агглютинировавших клеток - оценка (14), бактериальная суспензия после смешивания с сывороткой остается гомогенномут5 ной -оценка (-), отрицательная реакция.

РА, оцениваемая на (4+/3+) свидетельствует о высоком количестве синтезируемого антигена, на (2+/1+) - реакция сомнительная, необходима проверка в дополнитель0 ных экспериментах. Обнаружение фимбриального антигена под электронным микроскопом в виде специфичной нитчатой структуры на поверхности клеток повышает надежность выявления антигена F-41.

5 В результате постановки отсеивающего эксперимента было найдено, что наибольшее влияние на синтез антигена F-41 оказывает рН среды, концентрация аниона фосфорной кислоты и глюкозы. Значение

0 указанных компонентов питательной среды для синтеза антигена F-41 было дополнительно проверено в серии однофа.кторных экспериментов. Предлагаемая питательная среда отличается количественным соотно5 шением входящих в нее компонентов. В среде Минка глюкоза и фосфатный буфер входят в.ингибирующий синтез антигена концентрациях, а рН и кислотный гидроли- зат казеина - в лимитирующих концентра0 циях, следствием чего является низкий уровень диагностически значимого антигена и трудности при установлении отличий в Ра между клетками, содержащими антиген F-41, и клетками без антигена.

5 Предлагаемая питательная среда содержит указанные компоненты в концентрациях, оптимальных для синтеза F-41. Культуры, выросшие на этой среде, дают положительную РА (4+/3+) и под электронным микроскопом наблюдаются специфичные нитеподобные структуры на поверхности клеток,

П р и м е р 1. Проверка предлагаемой среды для выявления антигена F-41 производилась посевом штамма E.coli ВГНКИ 397А/37-14 (F-41) на питательную среду следующего состава, мае.%: Глюкоза.0,04

Гидролизат казеина кислотный0,25

Дрожжевой экстракт 0,005 Натрий фосфорно .-,

кислый двухзамещенный 0,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный0,07

Агар-агар1,5

Дистиллированная водаОстальное

рН7,9:-..:;:

После культивирования при 37°С 18 ч

оценки агглютинации референс-сывороткой составили (3+/4j.

Приме р 2. Выявление антигена F-41

проводили, как в примере 1, но при посеве;

референс-штамма на питательную среду

следующего состава, мас.%:

Глюкоза0,045

Гидролизат казеина 0,027 Дрожжевой экстракт 0,007 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,075 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,52 Агар-агар1,5

Дистиллированная.

водаОстальное

РН8,о... ;.;. . .

В РА получены оценки (3 /4. П р и м е р 3. Проверку предлагаемой среды проводили, как в примере 1, но при посеве на питательную среду следующего состава, мас.%:

Глюкоза0,05

Гидролизат казеина 0,30 Дрожжевой экстракт 0,01 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,55 . Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,08 Агар-агар1,5

Дистиллированная водаОстальное

рН8,1.Оценки в РА (3+/4+). Следовательно, найденные границы изменения состава питательной среды обеспечивают одинаковый уровень синтеза антигена F-41 и надежность его выявления. П р и м е р 4 (негативный). Проверку предлагаемой среды проводили, как в примере 1, но при посеве референс-штамма на питательную среду следующего состава, мас.%:

Глюкоза0,1

5Гидролизат казеина

кислотный0,25

Дрожжевой экстракт 0,05 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 1 0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,13 Агар-агар1,5

Дистиллированная водаОстальное

5 рН8,0

Оценки агглютинации (); П р и м е р 5 (негативный). Проверку предлагаемой среды проводили, как в примере 1, но при посеве референс-штамма на .0 питательную среду следующего состава, мас.%:.

Глюкоза0,1

Гидролизат казеина кислотный0,25

5 Дрожжевой экстракт 0,005 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,03 Калий фосфорнокис- лый однозамещенный 0,01 0 Агар-агар 1,5

Дистиллированная водаОстальное

рН8,0. ..

Оценки агглютинации (1+/-). 5 Следовательно, количество глюкозы и фосфатов за пределами/оптимального интервала ухудшает надежность выявления антигена F-41, так как чем больше отличается оценка РА от отрицательной, тем выше 0 надежность выявления антигена.

Пример 6. Клетки Ё.cot ВТНКИ 397А/37-14 выращивали на среде Минка и использовали для иммунизации кроликов. Иммунизацию проводили внутривенным 5 введением живой бактериальной суспензии в следующих дозах: 109,2 -109и8 :109 кл/кр. с недельным интервалом. Через 7-10 дней после последней инъекции делали забор крови и определяли титр антител к антигену 0 F-41. Из 8 иммунизированных кроликов только один кролик стал .донором специфичной сыворотки с титром РП 1 /2t у.остальных животных специфичных антител не обнаружили.

5 П р им ер 7, Клетки E.coli ВГНКИ 397А/37 () выращивали на предлагаемой питательной среде и проводили иммунизацию, как описано в примере 6. Было иепользовано 10 животных, от которых получена специфическая анти-Р-41 сыворотка с

титрами РА 1/10-1/16.

Специфическая иммуногенность клеток референс-штаммэ, выращенных на предлагаемой среде выше, чем иммуногенноеть того же штамма, выращенного на среде Минка, следовательно, содержание белка F- 41 больше на клетках эшерихий, выращенных в первом случае, чем во втором.

Формулаизобретения Питательная среда для выявления фим- бриального антигена адгезии F-41, содержащая глюкозу, гидролизат казеина кислотный, дрожжевой экстракт, натрий фосфорнокислый , двухзамещенный двух- водный, калий фосфорнокислый однозаме0

5

щенный агар-агар и воду, о т л и ч а ю щ а я- с я тем, что, с целью повышения селективности среды, компоненты содержатся при следующих количественных соотношениях, мас.%:

Глюкоза0,04-0,05

Гидролизат казеина кислотный0,25-0.30 Дрожжевой экстракт 0,005-0,01 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный Двухводный0,5-0.55 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,07-0,08 Агар-агар1,2-2 Вода Остальное рН 7,9-8,1.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано в ветеринарии.для выявления белка адгезии F-41 при диагностике колинфекции молодняка сельскохозяйственных животных. Целью настоящего изобретения является повышение селективности среды. Для этого используется питательная среда с рН 7,9- 8,1 при следующих количественных соотношениях компонентов, .мас.%:глюкоза 0,04-0,05; гидролизат казеина 0,25-0,30; дрожжевой экстракт 0,005-0,01; Na2HPCMx х2Н20 0,5-0,55; КНаРСм 0,07-0,08; агар- агар 1,2-2; дистиллированная вода остальное. . (Л