Способ определения ростовой характеристики питательных сред для клеточных культур Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 C12N5/00 

Изобретение относится к биоте х- нологии и может быть использовано для оценки ростовых свойств питательных среДл а та1сже для оценки токсичности их компонентов и раз- .личных добавок к питательньм средам-.

Целью изобретения является упрощение и ускорение-.способа.

Способ осуществляется слер;ующнм образом,

В исследуемой питательной среде измеряют содержани е карбонилы-гых соединений, выращивают на этой среде клетки ВНК-21 в качестве тест-культуры в течение дней,, подсчитывают их количествое оирелз;еляют ин-- декс пролиферации первого пассажа (ИП,) и измеряют уровень карбонильных соединений в надклеточной жид- КОСТИ5 затем по вьюеденному уравне-- кию для клеток ВНК-21 находят ожидаемое среднее значение индекса пролиферации по четырем пассажам (ИП,, )

Л Ч ... 47 Ч . ;

i TjJ 3/5-)

вГ

ИП

505

I где D, - величина прироста опт к- iческой плотности при

длине волны 505 им., сви:детельствующая об изме:нении, концентрации осно1ваний Юиффа, образующих ся при взаимодействии

;альдегидов (кетонов) с

2 J 4-динитрофенш11т;-1Дрази ном, характеризующая у:ро:вень карбонильных соедй

. не НИИ 5

ИП,- ивдекс пролифераи яи, соответствзпощий отношению количества гсгаеток после первого naccajsa к посадочной дозе;

№,-4° среднее значение индекса полиферации по четырем пассажам.

Уравнение получено на, основаш-ги статистического, анализа регрессиок-- ным методом базовых зксперименталь- ных данных (п - 32) j включающих измерение величинь ИП.4 s ИП, .DI для широкого набора различных по качеству питательных сред,; :пгриготов-- ленных на основе индивидуальных аъ&- нокислот 1-ши белковых гйдролизатоВо При значениях отношения D;J° /ИП) 0,25 питательные среды имеют ИП,|,.й

S

3 (для клеток ВНК-21) и .считаются .токсичными. При значениях этого отношения -с предлагаемый способ

позволяет предсказывать значения .Ш ,. 4 в интервале от 3 до 13 с доверительным интервалом + 2,6 ед. ИП при зфовн.е вероятности 95 %.

Наличие таких зависимостей связа0 но с TeMj что клетки при культивировании испытьгвают комплекс воздействий со стороны окружающей среды (наличие ионов переходных металлов, окислителей и т.д.), которые вызы5 вают интенсификацию процесса пере- кисного окисления липидов ведущего к накоплению карбонильных соединений ти.па малонового диальдегида. В некоторых случаях карбонильные

0 соединения в определенных концент- ра1щях сами по себе могут оказывать токсическое действие на клеточные. культуры.

Новыми признаками способа являютт- ся измерение содержания карбонильных соединений в питательной среде до и после выращивания на ней. популяции клеток ВНК-21 и определение ростовых свойств рассматриваемой пиO тательной средд 1 по приросту карбонильных соединений с использованием статистически отработанного уравнения,

Дан.ная совокупность признаков

5 способа приводит к значительному

сокращению времени проведения анализа, упрощению и удешевлению способа получе шя количественньпг характеристик ростовых свойств питательных

0 сред.

Способ определения ростовых характеристик питательных сред для клеточных культур ВНК-21 позволяет с в течение одной рабочей смень про- тестировать шести образцов питательных сред. Способ целесообразно применять ,гр1Я оценки рортовых свойств при конструировании новых питательных сред, пригодности сырья в производстве питательных сред, а также при изучении влияния различных химических вещес-тв на рост клеточных культур и таким образом экономить время, материалы, реактивы и снижать трудозатраты. Он расширяет арсенал средств для контроля токсичности и ростовых свойс1-в сырья., питательных сред и добавок к ним.

Пример. Измеряют содержание карбонильных соединений в анализируемой питательной среде по их реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Для этого в пробирку, содержащую 0,6 мл анализируемой среды, добавляют 0,5 мл 052%-ного pacTBcfpa 2,4- -динитрофенилгидразина в 1 н раствора соляной кислоты, затем 2 мл 0,4 н. NaOH. Пробу выдерживают оба раза при комнатной температуре в течение 10-15 мин и измеряют оптическую плотность поглощения раствора при длине волны 505 нм с ромощью спетрофото- метра СФ-16 в кювете (1 1 см).

Далее вьфащивают клетки ВНК-21 на анализируемой среде. Для этого клетки, вьщерживаемые на контроль- йой питательной среде, разводят в стерильных условиях до оптимальной посевной концентрации анализируемой питат,ельной средой и рассеивают в два (или 3-4) культуральньк сосуда с посадочной дозой 100 тыс.кл/мл, закрывают пробками и маркируют. Куль- туральные сосуды инкубируют в термостате при 37°С; через три дня над- клеточную жидкость сливают для оценки уровня кapбoниль ыx соединений с помощью 2,4-динитрофенилгидразина и подсчитьшают клетки, предварительно переводя их в суспензию, с помощью камеры Горяева (нестерильно), определяя таким образом величину ШТ . При оценке уровня карбонильных соединений и подсчете количества клеток используют оба культуральных сосуда для определения средних арифметических указанных величин.Прогнозируемое среднее значение индекса пролиферации по четырем пассажам (ИП . 4 ) вычисляют по формуле.

Результаты таких расчетов для опытных сред (Ш,. ) в сопоставлении с экспериментальными данными (Ж,. 4 9vcnepiiwenT ) О известному способу Угриведены в таблице.

Из приведенных в таблице данных следует, что расчетные и экспериментальные величины для питаль- ных сред 2-6 находятся в удовлетворительном согласии и свидетельствуют о высоких ростовых свойствах. Для образца 1 получено расчетное значение ИП,.|, равное 0,3, что свидет тельствует о токсичности этой питатательной среды (

пГ йп,

0,25). Эта

величина также удовлетворительно согласуется с э кспериментальным значением ИП.4

Приведенные данные подтверждают применимость предлагаемого способа для определения ростовых характеристик питательных сред.

Формула изобретения

1. Способ определения ростовой характеристики питательных сред для клеточных культур, предусматривающий выращивание тест-культуры на испытуемой среде и определение среднего значения индекса пролиферации по первым четырем пассажам с последующей оценкой полученных результатов, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, среднее значение индекса пролиферации по первым четырем пассажам определяют путем измерения содержания карбонильных соединений в питательной среде до и после культивирования тест-культуры в течение первого пассажа и по приросту их концентрации в расчете на одну клетку, а оценку полученных результатов производят по формуле:

14,3 - 57,3

5Г

ИП,

где D

SOS

величина прироста опти- 40ческой плотности при

длине волны 505 нм, ха- рактеризуницая уровень карбонильных соединений ИП° - индекс пролиферации, 45соответствующий отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе; ИП,.- среднее значение индек- 50са пролиферации по четырем пассажам.

2. Способ поп.1,отличаю- щ и и с я тем, что в качестве тест- культуры используют штамм культиви- 55 руемых клеток животных ВНК-21.

I Приведенные в таблице питатель- ifOae среды не входят в число базовых |соторые бьши использованы для опре- J eлeния коэффициентов уравнения. I Среда пес (ВНК-21) содержит, ilir/л: NaCl 5800, КС1 360; )f2H20 140; CaCls 90; MgSOv 7НаО 180 1 люкоза 4500; феноловый красный 7,, |-аргинин НС1 127,6; 1-цистин 32; 1-глутамин 584; 1-гистидин НС1 11j 1--изолейцин 25; 1-лейщ1Н 33; 1-лизин 40; 1-метионин 38; 1-фениланин 15| 1-треонин 46; 1-трШ1тофан 15; 1-ти- 32; 1-валин 50; 1 серин 56; з олинхлорид. 3; фолиевая кислота 3, 1 |гезоинозит 6; никотинамид 3, панто- енат кальция 3; пиридоксаль гидро- фпорид 3, тиамингидрохлорид 3; рибо- фтавин 0,,3; NaHCOj 2500; сьторотка Крупного рогатого скота 100 мл/л,

Для приготовления этих питательных сред используют аминокислоты фирмы Сигма (США)9 остальные реактивы отечественного производотва квалификации ч. и х,ч, В одном случае к среде ПСС(ВНК-21) добавляют дополнительно 127,6 мг/л 1-аргинин гидрохлорида.

В средах ПСЯ 40Р, ПСЯ 44Р и ПСЯ 45Р вместо 1-гистидина, 1-изолейци- на, 1-лейцина, 1-лизина, 1-метиони- на, Х-фенилаланина, 1-треонина, 1- тйрозина, 1-вапина и 1-серина добавляют 2220 мг/л ферментативного гид- ролизата протеинов миражного яйца (отходы птицеводства), полученного в разных условиях (40Р-длительность гидролиза 4 ч, без очистки; 44Р - длительность гидролиза 5 ч, без очистки; 45Р - длительность гидролиза 5 ч, очистка с активированным углем марки ОУА).

Доверительный интервал 1 при уровне вероятности 95 % получен в результате статистического анализа отклонения базовых экспериментальных данных (п 32) от их значений вычисленных по формуле,

Доверительный интервал при уровне вероятности 95 % получен в результате статистического анализа вариаций при экспериментальном определении S при этом используют усредненное значение величины квадратичного отклонения для четырех пассажей.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для оценки ростовых свойств питательных сред, а также для оценки токсичности их компонентов и различных добавок к питательным средам. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том, что в исследуемой питательной среде измеряют содержание карбонильных соединений , выращивают на этой среде клетки ВНК-21 в качестве тесткультуры в течение 2-4 дней, подсчитывают их количество, определяют индекс пролиферации первого пассажа и измеряют уровень карбонильных соединений в надклеточной жидкости. Затем по выведенному уравнению для клеток ВНК- 21 находят ожидаемое среднее значение индекса пролиферации по четырем D пассажам: Ш1,.4 14,3-57,3 , где П , величина прироста оптической плотности при длине волны 505 нм, свидетельствующая об изменении концентраций оснований Шиффа, образующихся при взаимодействии апь- дегидов (кетонов) с 2,,4-диннтрофе- нилгидразином, характеризующая уровень карбонильных соединений; ИЩ- индекс пролиферации, соответствующий отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе; Ш1,.4- среднее значение индекса пролиферации по четырем пассажам. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. с $ ьэ ел сд to