ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК Российский патент 2023 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и может быть использовано в вирусологических лабораториях при проведении исследований, а также на биокомбинатах, при производстве вакцин. Предлагается в качестве источника питательных веществ и ростовых факторов для перевиваемых культур клеток вместо среды Игла-МЕМ использовать 0,25% раствор ферментативного гидролизата машечной массы тушек норки на солевом раствором Эрла.

Из уровня техники известна питательная среда для культивирования перевиваемых клеток Игла-МЕМ на солевым раствором Эрла, которая производится из сухого порошка различных фирм («HyClone» USA, «Biolodical Industry» Israel и др.). Основным недостатком этой среды является необходимость использования высокоочищенных синтетических аминокислот, тестированных в культуре клеток, что обусловливает ее высокую стоимость.

В заявленной среде источником питательных веществ и ростовых факторов для перевиваемой культуры клеток является изготовленный промышленным путем ЗАО «Биопрогресс» РФ, по разработанной нами оригинальной технологии, ферментный гидролизат мышечной массы норок.

Гидролизат содержит 18 аминокислот, в том числе незаменимые аминокислоты - аргинин (4,54 %), валин (3,72%), гистидин (1,85%), изолейцин (5,4%), лизин (5,35%), метионин (1,55%), треонин (3,31 %), триптофан (1,21%), фениламин (2,70%), а такжевосемь заменимых аминокислот. Микроэлементный состав гидролизата представлен 18 микроэлементами, в том числе эссенциальными йод, медь, цинк, железо, кобальт.

Целью изобретения является получение доступной питательной среды без использования зарубежных компонентов и обладающей невысокой себестоимостью.

Техническим результатом заявленного изобретения является простота приготовления среды, отсутствие токсичности, полноценность аминокислотного содержания, и ее использование для культивирования обеспечивает рост разных перевиваемых линий клеток.

Заявленный технический результат достигается за счет того, что питательная среда для культивирования перевиваемых культур клеток содержит в качестве источника питательных веществ и ростовых факторов 0,25 % сухого порошка ферментного гидролизата мяса норок, растворенного в солевом растворе Эрла. При помощи гидрокарбоната натрия раствор доводят до pH 7,4. Затем раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, и перед применением вносят сыворотку крови КРС в пропорции, рекомендованной для конкретной культуры клеток.

Изобретение иллюстрируются результатами сравнительного изучения роста перевиваемых линий клеток на известной и экспериментальной среде. При этом были использованы следующие линии перевиваемых культур клеток из коллекции ФГБНУ ФИЦВиМ:

ВНК-21\13 - перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомяка;

ППК-66б - монослойно-суспензионная клональная сублиния перевиваемых клеток почки эмбрион свиньи;

ПО (ВНИИВВиМ) - перевиваемая линия клеток почки овцы.

Оценку токсичности и ростовых свойств сравниваемых питательных сред проводили в монослойных культурах указанных перевиваемых линий клеток методом последовательных пересевов в течение пяти пассажей при посевной плотности 100 ± 10 тысяч клеток\мл.

Сыворотку крови КРС в исследуемую и контрольную среды добавляли в соответствии с паспортными характеристиками и требованиями каждой культуры клеток.

Результаты сравнительной оценки токсичности и ростовых свойств опытной среды 0,25% ферментативного гидролизата мышц норок и контрольной среды Игла-МЕМ приведены в таблице 1.

Таблица № 1 №
п\п Наименование ПЛК Питатель
ная среда Количес
тво пассажей Срок формирования моно слоя (час) Индекс пролифе-рации
(ИП) Цитоморфологическая характе
ристика 1 ВНК-21\13
(Англия) 0,25% фермента
тивный гидролизат мяса норок на солевом растворе Эрла 5 24 3,00±0,12 Соответ
ствует паспортной характеристике Игла-МЕМ на солевом раствореЭрла
КОНТРОЛЬ 5 24 2,90±0,19 Соответствует паспортной характеристике 2 ППК-66б 0,25% фермента
тивный гидролизат мяса норок на солевом растворе Эрла 5 48 2.80±0,20 Соответствует паспортной характеристике Игла-МЕМ на солевом растворе Эрла
КОНТРОЛЬ 5 48 2,75±0,12 Соответствует паспорт
ной характеристике 3 ПО (ВНИИВВиМ) 0,25% ферментативный гидролизат мяса норок на солевом растворе Эрла 5 48 2,20±0,23 Соответствует паспортной характеристике Игла-МЕМ на солевом растворе Эрла
КОНТРОЛЬ 5 48 2,30±0,10 Соответствует паспорт
ной характе
ристике

Анализ таблицы № 1 свидетельствует о том, что экспериментальная среда с 0,25% ферментативного гидролизата мышечной массы норок на солевом растворе Эрла нетоксична для перевиваемых линий клеток. Ростовые свойства перевиваемых культур клеток (срок формирования монослоя и индекс пролиферации) в экспериментальной среде соответствуют таковым в контрольной среде Игла-МЕМ.

Список литературы

1. Абрамов П.Н. Белковые гидролизаты в профилактике метаболических нарушений у пушных зверей / П.Н. Абрамов, Н.А. Слесаренко, С. В. Позябин [и др.]. - Москва : ЗооВетКнига, 2022. - 184 с.

2. Дьяков Л.П. Живая клетка в культуре. Москва: Спутник, 2009. - 656 с.

3. Патент РФ № 2546252 C2, МПК A23K 1/10. Способ получения белкового гидролизата из мясного или мясокостного сырья тушек норок для парентерального питания: № 2013116939/10 от 15.04.2013; опубл. 10.04.2015 / А.И. Албулов, В.Н. Денисенко, А.Я. Самуйленко [и др.]; Заявитель Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук.

4. Юрков С.Г., Колбасова О.Л. и др. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ. Покров, Россельхозакадемия, ВНИИВВиМ, 2010; 89 с.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в вирусологических лабораториях, при проведении исследований, а также на биокомбинатах, при производстве вакцин. Питательная среда для культивирования перевиваемых культур клеток содержит в качестве источника питательных веществ и ростовых факторов 0,25% сухого порошка ферментативного гидролизата мяса норок, растворённого в солевом растворе. Получена нетоксичная среда полноценного аминокислотного содержания, используемая для культивирования и обеспечения роста разных перевиваемых линий клеток. 1 табл.

Питательная среда для культивирования перевиваемых культур клеток, содержащая в качестве источника питательных веществ и ростовых факторов 0,25% сухого порошка ферментативного гидролизата мяса норок, растворённого в солевом растворе с конечной pH среды, доведённой до значения 7,4 при помощи раствора гидрокарбоната натрия и последующей стерилизации методом мембранной фильтрации и внесения перед применением сыворотки крови КРС.