BHK-21/SUSP/ARRIAH - перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов Российский патент 2020 года по МПК C12N5/10 

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии, а именно к получению и описанию основных характеристик перевиваемой клеточной сублинии из почки новорожденного сирийского хомячка (Baby Hamster Kidney, BHK-21/SUSP/ARRIAH), предназначенной для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.

Перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13 получена в 1961 году в Англии И. Максферсоном и М. Стокером [1] и распространилась по всему миру. В последующем были получены следующие аналоги данной культуры клеток:

1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в Институте полиомиелита [2];

2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в НИИС [3].

3. ВНК-21/2-17b - перевиваемый монослойно-суспензионный клон клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученный во ВНИЯИ (Всероссийский научно-исследовательский ящурный институт) [4, 5] (наиболее близкий прототип).

4. ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства, получена в ФГУП «Щелковский биокомбинат» [6];

5. ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура типов А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и вируса бешенства штамма Щелково-51, используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства, получена в ФГУП «Щелковский биокомбинат» [7].

Эти и другие линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка используют для культивирования вирусов ящура и бешенства. Используемые перевиваемые клеточные линии различают по морфологии, кариологии, ростовым свойствам, особенностям культивирования, способам поддержания и чувствительности к вирусам.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13 [2].

Клеточная сублиния ВНК-21/13 адаптирована к выращиванию в пристеночных условиях. Клетки отделяют от стекла с помощью 0,25% раствора трипсина, подогретого до температуры 37°С.

Ростовые свойства. При пересеве с коэффициентом 1:2-1:3 клеточный монослой формируется на 2-3 сутки после эксплантации. При условии коррекции рН среды до 7,5-7,6 сформированный монослой сохраняется до 5-6 суток. В культуральном флаконе объемом 1,5 м³ накапливается 40-45 млн клеток.

Морфология. Клетки фибробластоподобные.

Кариология. Культура клеток ВНК-21/13 резко гетероплоидная с вариабельностью хромосомных наборов от 32 до 78. Стволовую линию (модальный класс) составляют клетки с 40 хромосомами (32-34%), 4-6% клеток в популяции сохраняют диплоидный набор хромосом.

Среда для замораживания представляет собой культуральную среду с добавлением диметилсульфоксида (DMSO) в количестве 10% от общего объема. Восстановление после хранения в жидком азоте происходит на 85-95%. Клеточная линия восстанавливает исходные ростовые свойства на 2-3 пассажах.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК21/13 [3].

Среда культивирования. Для суспензионного выращивания клеточной линии ВНК21/13 применяют среду Игла MEM, обогащенную серином (120 мг/дм³) и L-глутамином (610 мг/дм³) с добавлением 0,25% гидролизата лактоальбумина (ГЛА) и 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС). При пристеночном культивировании применяют среду Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови КРС (рН среды 7,5-7,6).

Способ поддержания. Клеточная линия ВНК21/13 поддерживается в суспензионных условиях в реакторах различной емкости. При этом клетки сохраняют способность расти в пристеночных культурах. В этом случае при очередном пассировании клеточный пласт диспергируют 0,25% раствором трипсина, подогретого до температуры 37°С.

Ростовые свойства. В суспензионной культуре при посеве в концентрации 500 тыс.клеток/см³ обеспечивается 3-4 кратный прирост популяции на 3-4 сутки. При коэффициенте пересева 1:3 монослой формируется в пристеночных культурах на 2-3 сутки и сохраняет целостность и жизнеспособность не более 3 суток.

Морфология. Клетки эпителиоподобные.

Кариология. Популяция клеток ВНК21/13 гетероплоидная с разбросом числа хромосом в клетках от 20 до 78. Модальный класс составляют клетки с диплоидным набором хромосом (16-24%).

Среда для замораживания представляет собой культуральную среду с добавлением диметилсульфоксида (DMSO) в количестве 10% от общего объема. Жизнеспособность клеток после хранения в жидком азоте составляет 88-96%. Клеточная линия восстанавливает исходные ростовые свойства на 1-2 пассажах.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17b [4, 5].

Данная клеточная линия является наиболее близким прототипом по отношению к заявляемому изобретению. Сублиния ВНК-21/2-17b получена во ВНИЯИ [4, 5] и хранится в жидком азоте на уровне 13 пассажа.

Среда культивирования. Для культивирования данной линии клеток применяют 0,25% мышечный гидролизат на растворе Эрла (для монослойных культур) и раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением 5 аминокислот (аргинин, глутамин, метеонин, цистин, серии), 8 витаминов группы В, 5% сыворотки крови КРС (рН среды 6,8-7,2).

Способ поддержания. Суспензионную культуру выращивают - отъемно-доливным методом, монослойную - в культуральных сосудах любой емкости. При очередном пересеве для диспергирования применяют смесь 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1.

Ростовые свойства. Через 48 часов культивирования в суспензии культура ВНК-21/2-17b дает 6-7 кратный прирост, достигая конечной концентрации 2,3-2,8 млн клеток/см³. При монослойном выращивании с посевной концентрации 0,05-0,10 млн клеток/см³ монослой формируется на 2-3 сутки.

Морфология. В суспензии культура ВНК-21/2-17b представлена одиночными блестящими, округлыми клетками. В монослое популяция состоит из эпителиальных и фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой.

Кариология. Культура гетероплоидная. Модальный класс представлен клетками с 42 хромосомами, составляющими в популяции 28-40%).

Среда для замораживания представляет собой культуральную среду с добавлением диметилсульфоксида (DMSO) в количестве 10%) от общего объема. Жизнеспособность клеток после хранения в жидком азоте составляет 85-90%. Клеточная линия восстанавливает исходные ростовые свойства на 2-3 пассажах.

Чувствительность к вирусам. Культура клеток чувствительна к вирусу ящура типа А, О, С, Азия-1.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-02 [6].

Перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-02 получена на Щелковском биокомбинате и предназначена для репродукции вируса ящура, вируса бешенства штамма Щелково-51, используемых для изготовления вакцин против ящура и бешенства [6].

Клетки ВНК-21/13-02 характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, накопление которого в среднем составляет 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, при содержании иммуногенных компонентов до 1,00 мкг/см³. Клетки чувствительны также к вирусу бешенства, обеспечивая репродукцию вируса со средним титром инфекционной активности 6,50 lg ЛД₅₀/см³.

Сублиния ВНК-21/13-02 адаптирована к суспензионному способу культивирования с использованием ростовой среды на основе солевого раствора Хенкса, содержащей 5-7% сыворотки крови КРС, 0,125% гидролизата мышечных белков и 0,125% гидролизата лактальбумина (ГЛА) с добавлением пяти аминокислот: L-аргинина 0,042 г/дм³; L-глутамина 0,584 г/дм³; L-тирозина 0,020 г/дм³; L-триптофана 0,015 г/дм³; L-цистина 0,032 г/дм³ и семи витаминов группы В: холин-хлорид 0,0034 г/дм³, пантотенат кальция (В₅) 0,0034 г/дм³, пиридоксаль-HCl 0,0034 г/дм³, тиамин (B₁) 0,0034 г/дм³, миоинозит 0,0068 г/дм³, никотинамид 0,0034 г/дм³, рибофлавин (В₂) 0,00034 г/дм³, фолиевая кислота (В₉) 0,0034 г/дм³.

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными округлыми клетками с небольшим количеством конгломератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой, иногда образуется единый цитоплазматический пласт без границ между клетками с наличием большого количества ядер. Отмечается присутствие 2-4 и более ядерных симпластов, лежащих изолированно или в структуре клеточного пласта. Отмечается отпочковывание ядер от общей ядерной массы и формирование микроядер в результате разрушения ядра. Часть клеток отделяется от стекла и растет в суспензии.

Способы культивирования. Монослой клеток ВНК-21/13-02 выращивают в культуральных флаконах любой емкости. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:9, нагретую до 37°С. Клетки снимают бесцентрифужным методом и ресуспендируют в ростовой среде до посевной концентрации. В суспензии культуру клеток выращивают отъемно-доливным способом в течение 48 часов до 10-50 последовательных пассажей.

Кариология. В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98, модальный класс (22%) составляют клетки с 44 хромосомами. Кариотип суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствует кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составляют клетки, содержащие 42 хромосомы.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-13 [7].

Перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-13 предназначена для репродукции вируса ящура типов А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и вируса бешенства штамма Щелково-51, используемых для изготовления вакцин против ящура и бешенства [7].

Клетки характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается в количестве около 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, при содержании иммуногенного компонента до 1,50 мкг/см³ (в наиболее близком аналоге, с использованием культуры клеток ВНК 13/02 - до 1,00 мкг/см³). Для клеток данной сублинии характерна повышенная чувствительность к вирусу бешенства, репродукция которого позволяет достичь титров инфекционной активности 6,50-8,00 lg ЛД₅₀/см³.

Клетки сублинии ВНК-21/13-13 отличаются высоким индексом пролиферации, который при суспензионном культивировании к 48 часам составляет 6-8 при жизнеспособности клеток 95-98%. С помощью заявляемой су 6 линии получают на 50% больше конечного продукта по сравнению с аналогом (сублиния ВНК-21/13-02).

Морфология. В суспензии сублиния ВНК-21/13-13 представлена одиночными фибробластоподобными клетками с прозрачной гомогенной цитоплазмой. Отмечается формирование отдельных конгломератов, состоящих из 5-10 клеток.

Кариология. Число диплоидных метафазных пластинок (2n=44) составляет 17% от общего числа. Разброс числа хромосом в клетках культуры колеблется от 20 до 64, модальный класс представлен пластинками, содержащими 30 хромосом, что составляет 43%.

Способ культивирования. В суспензии культуру клеток выращивают в течение 48 часов до 50 последовательных пассажей.

Суспензионное культивирование проводят в реакторах емкостью 4, 40, 100, 600 и 2000 л с рабочими объемами 3, 30, 60, 450 и 1800 л, соответственно, при следующих параметрах:

- посевная концентрация - 0,4⋅10⁶-0,5⋅10⁶ клеток/см³;

- скорость перемешивания - 25-40 об/мин;

- температура культивирования - 36,0-36,5°С;

- рН среды - 6,50-7,15;

- аэрация путем барботирования воздухом в количестве 0,5-1,5 л воздуха/л суспензии.

Представленные выше сублинии клеток почки новорожденного сирийского хомячка отличаются довольно высокими показателя интенсивности прироста и позволяют проводить репродукцию вирусов ящура и бешенства. При этом для промышленного получения культуральных вакцинных препаратов против ящура, бешенства, а также парагриппа-3 КРС и болезни Ауески требуется суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, обеспечивающая накопление вирусов с более высокими значениями титров инфекционной активности и количествами антигенных компонентов, определяющих такой важный показатель качества вакцин, как их иммуногенность. Прототипные клеточные линии почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13) позволяют получать вирус ящура с титрами инфекционной активности не более 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, вируса бешенства - 8,00 lg ЛД₅₀/см³. Концентрации иммуногенных компонентов в получаемых вирусных суспензиях с применением данных клеточных сублиний составляют для вируса ящура не более 1,5 мкг/см³ [7]. Сведения о результатах культивации вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в тексте патентов на сублинии клеток ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13 не обнаружены.

В связи с этим целесообразно получить альтернативную сублинию клеток почки новорожденного сирийского хомячка, позволяющую удовлетворить нужды производственного процесса по репродукции вируса ящура с титрами инфекционной активности выше 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ и накоплением иммуногенных компонентов более 1,5 мкг/см³, вируса бешенства с титрами выше 8,00 ЛД₅₀/см³, а также вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески с титрами инфекционной активности 6,00 lg ТЦД₅₀/см³ и выше.

Задачей изобретения являлось получение новой перевиваемой суспензионной сублинии клеток, позволяющей по сравнению с прототипным вариантом значительно повысить титр инфекционной активности вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС, болезни Ауески и увеличить концентрацию их иммуногенных компонентов при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.

Данная задача решена благодаря созданию перевиваемой суспензионной сублинии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRI АН, предназначенной для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС, болезни Ауески и производства противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.

Полученная сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH характеризуется высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается за 8-15 ч в количестве до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³, при содержании иммуногенных компонентов 0,50-1,95 мкг/см³ с 1,0 млн клеток. При использовании культуры клеток ВНК-21/13-02 (аналог) титр вируса ящура составляет до 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, количество иммуногенных компонентов - до 1,00 мкг/см³ со всей популяции клеток. Применяя сублинии клеток ВНК-21/13-13 и ВНК-21/2-17b (аналоги), титр инфекционности вируса ящура достигает также 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ с концентрацией иммуногенных компонентов до 1,50 мкг/см³ со всей популяции клеток.

Сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проявляет высокую чувствительность к заражению вирусом бешенства и обеспечивает за 48 ч накопление вируса с титрами до 8,50 lg ЛД₅₀/см³. Прототипная клеточная сублиния ВНК-21/13-02 позволяет проводить репродукцию возбудителя бешенства с конечными значениями титра инфекционной активности до 6,50 lg ЛД₅₀/см³, а линии ВНК-21/13-13 и BHK-21/2-17b - до 8,00 lg ЛД₅₀/см³.

Клеточная сублиния ВНК-21/SUSP/ARRI АН дает возможность проводить репродукцию вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески с титрами инфекционности до 6,00 и 7,80 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. В текстах патентов на прототипные клеточные сублинии из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13) информация о получении вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески не обнаружена.

С помощью заявляемой сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH для производства противоящурных вакцин и для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов возможно получать антигенный материал с титром на 1,00 lg ТЦД₅₀/см³ выше (до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³) и концентрацией иммуногенных компонентов в 2-3 раза выше (до 1,95 мкг/см³ с 1 млн кл.) по сравнению с аналогами (не более 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ и 1,50 мкг/см³ со всей популяции клеток). Предложенная сублиния позволяет проводить репродукцию вируса бешенства с титром на 0,50 lg ЛД₅₀/см³ выше (до 8,50 lg ЛД₅₀/см³) по сравнению с прототипными линиями (не более 8,00 lg ТЦД₅₀/см³), а также получать вирусы парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в количествах 6,00 и 7,80 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Экспоненциальный характер роста концентрации клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с затуханием пролиферации после 48 часов суспензионного культивирования.

Фиг. 2 - Кариограмма популяции клеток сублинии ВНК-21/2-17b на момент патентования (1986 г.).

Фиг. 3 - Морфология клеток сублинии ВНК-21/2-17b (1 пассаж).

Фиг. 4 - Морфология клеток сублинии ВНК-21/2-17b (2 пассаж).

Фиг. 5 - Кариограмма клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Анализ популяции из культиватора стеклянного объемом 50 дм³ (количество исследований (N)=50).

Фиг. 6 - Кариограмма клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Анализ популяции из культиватора металлического объемом 1000 дм³ (N=50).

Фиг. 7 - Кариограмма клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Анализ популяции из культиватора металлического объемом 2000 дм³ (N=50).

Фиг. 8 - Морфология клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Фиг. 9 - Визуализация ядер суспензионных клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при окрашивании акридиновым оранжевым.

Фиг. 10 - ДНК-гистограмма клеток сублиний ВНК-21/SUSP/ARRIAH (А) и ВНК-21/2-17b (наиболее близкий прототип) (В).

Фиг. 11 - Изменение кратности прироста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, рекультивированных после криоконсервирования (указаны средние значения кратности прироста, N=30, р<0,005).

Заявляемые преимущества изобретения обусловлены генетическими характеристиками созданной сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая была получена путем перманентного культивирования в суспензии сублинии клеток ВНК-21/2-17b на протяжении 30 лет, а также подбором ростовой среды оригинального состава.

Перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH адаптирована к суспензионному способу выращивания с использованием ростовой среды на основе раствора Хенкса, в который добавляют 15-20 см³/дм³ 10%-ого гидролизата белков крови, 5% сыворотки крови КРС и 2-10 см³/дм³ 10%-ого перевара по Хоттингеру. Рецептура данной ростовой среды включает в себя также добавление 8 протеиногенных аминокислот: 128,3 мг/дм³ L-аргинина, 584,0 мг/дм³ L-глутамина, 7,6 мг/дм³ L-изолейцина, 26,4 мг/дм³ L-метионина, 12,6 мг/дм³ L-тирозина, 35,7 мг/дм³ L-треонина, 15,0 мг/дм³ L-триптофана, 32,0 мг/дм³ L-цистеина. В качестве моносахаров применяют глюкозу в количестве 4000 мг/дм мг/дм³. Состав ростовой среды включает в себя следующий витаминный комплекс: инозитол (6,0 мг/дм мг/дм³), никотинамид (3,0 мг/дм³), пантотенат кальция (3,0 мг/дм³), пиридоксаля гидрохлорид (3,0 мг/дм³), рибофлавин (0,3 мг/дм³), тиамин (3,0 мг/дм³), фолиевая кислота (3,0 мг/дм³), холина хлорид (3,0 мг/дм³). В качестве минеральных компонентов применяют следующие неорганические соли: калий фосфорнокислый (60,0 мг/дм³), калий хлористый (400,0 мг/дм³), кальций хлористый 6-водный (140,0 мг/дм³), магний сернокислый (200,0 мг/дм³), гидрокарбонат натрия (400,0 мг/дм³), дигидрофосфат натрия (150,0 мг/дм³), натрий хлористый (8000,0 мг/дм³) (таблица 1).

Преимуществом ростовой среды данного состава для культивирования клеток сублинии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH является использование жидкого гидролизата белков крови и перевара по Хоттингеру, которые обеспечивают богатый аминокислотный состав среды, а, следовательно, и более высокие ростовые свойства клеток. Проведен сравнительный анализ качественного и количественного аминокислотного состава используемой ростовой среды до и после добавления ГБК и перевара по Хоттингеру. Результаты исследования отражены в таблице 2, из которой следует, что готовая ростовая среда содержит больше L-аргинина на 21,62 мг/дм³, L-изолейцина на 150,00 мг/дм³, L-метионина на 28,86 мг/дм³, L-тирозина на 49,60 мг/дм³, L-треонина на 130,28 мг/дм³, L-триптофана на 38,20 мг/дм³, L-цистеина на 146,00 мг/дм³ по сравнению со средой без ГБК и перевара по Хоттингеру.

Полученная клеточная сублиния ВНК-21 /SUSP/ARRIAH депонирована 23 апреля 2019 г. в Институте цитологии РАН «Специализированная коллекция культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных»». Линии клеток присвоен номер: №РККК(П) 797 Д.

Перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13 получена в 1961 году в Англии Максферсоном и Стокером. Путем селекции данной культуры клеток во ВНИЯИ (Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт) была получена клеточная сублиния ВНК-21/2-17b, из которой через 30 лет путем перманентного культивирования в суспензии получена новая сублиния ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Морфологическая характеристика клеточной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при выращивании на субстрате не имеет постоянной формы, иными словами, ее можно охарактеризовать как «аморфная». В оптимальных условиях культивирования на клетках наблюдается большое количество высокоподвижных цитоплазматических выростов с динамикой в несколько минут; в суспензионном состоянии клетка характеризуется сферической формой с множеством микровыростов.

Способы и условия культивирования клеточной сублинии BHK-21/SUSP/ARRIAH.

Суспензионное культивирование. Клетки су 6 линии

ВНК-21/SUSP/ARRIAH выращивают отъемно-доливным способом, раздельными циклами по 10-12 пассажей. При посевной концентрации 0,50-0,60 млн клеток/см через 48 часов культивирования в оптимальном режиме концентрация составляет 4,00-5,50 млн клеток/см. Иными словами, кратность прироста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH составляет 6,67-11,00 при жизнеспособности клеток 96-99%. В процессе культивирования проводится аэрация суспензии стерильным воздухом в количестве 0,5-1,7 л воздуха/л среды. Температура культивирования клеток составляет 37,0±0,5°С, Водородный показатель среды поддерживается в пределах 6,6-7,2 путем добавления 7,5%-ого раствора бикарбоната натрия. Общая тенденция суспензионного культивирования клеточной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 48 часов имеет стандартную динамику роста (экспоненциальный характер роста с затуханием пролиферации после 48 часов культивирования) (фиг. 1).

Следует отметить сформированную у клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH ацидофильность, толерантность к более низким значениям водородного показателя (рН<7,0) по сравнению с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b, клетки которой культивировали в среде с нейтральным и слабощелочным показателями рН.

Монослойное культивирование клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Суспензионные клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при выращивании в культуральных флаконах адгезируются в небольшом количестве на поверхности, не имеют постоянной формы и формируют цитоплазматические выросты разной длины с динамикой в несколько минут.

Закономерности роста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

В начале логарифмической стадии роста активизируется синтетическая фаза (S) и уменьшается относительное количество диплоидных клеток. Пресинтетическая фаза (G1) стабилизируется и относительно уменьшается до конца культивирования. При этом увеличивается относительное количество тетраплоидных (G2) клеток и клеток, находящихся в метафазе (М).

В клеточном цикле популяции преобладает диплоидная фаза цикла (G1), на которую приходится 30 до 75% клеток в зависимости от условий культивирования. В фазе подготовки к митозу и митотического деления находится от 3,0 до 20% всей популяции. Количество крупноядерных и многоядерных клеток (>4n) увеличивается в начале и в конце стадии логарифмического роста, но количество их не превышает 2%.

Кариологическая характеристика клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH выделена из культуры ВНК-21/2-17b путем прохождения около 100 пассажей в суспензии в течение 30 лет, минуя монослойную стадию, вследствие чего изменилась кариологическая картина.

Кариологическое исследование сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили с применением метода Moorhead и др. [8]. После получения препарата с метафазными пластинками, производилось фотографирование 100 метафазных пластинок, далее их подсчет и составление кариограммы. По результатам исследования выяснили, что сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH образует неоднородную по кариологическим признакам популяцию клеток, в основном анеуплоидных. Модальный класс - 41 хромосома (32-40%), доля клеток с количеством хромосом 40-42 составляет 78-80%, полиплоидов - менее 1%. Пределы изменчивости хромосом для суспензионных клеток данной сублинии составили 36-54. Представленная сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH отличается от прототипов по кариологическим показателям. Кариологическая характеристика для культуры ВНК-21/2-17b (наиболее близкий прототип): модальное число хромосом 42 (28-40%), пределы изменчивости хромосом - 37-44. Кариологическая характеристика клеток сублинии ВНК-21/13-02: модальное число хромосом 42, пределы изменчивости хромосом - 31-80 для суспензионных клеток; в монослойной культуре модальное число хромосом 44, пределы изменчивости хромосом - 31-98. Кариологическая характеристика клеток сублинии ВНК-21/13-13: число диплоидных метафазных пластинок 2n=44 составляет 17% от общего числа. Разброс числа хромосом в клетках культуры колеблется от 20 до 64, модальный класс представлен пластинками, содержащими 30 хромосом, что составляет 43% (таблица 3).

Видовая принадлежность клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Культура идентифицирована как ткань почки новорожденного сирийского хомячка, с помощью дифференциального С-окрашивания хромосом.

Криоконсервация и жизнеспособность клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH после криоконсервации. Для хранения суспензии клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при температуре -70°С используют пластиковые культуральные флаконы. Для длительного хранения при температуре -196°С применяют ампулы. Консервацию клеток осуществляют в криосреде (ростовая среда (состав отражен в таблице 1) с добавлением 7-10% этиленгликоля и 20% фетальной сыворотки КРС) в ампулах объемом 80 см³ с концентрацией клеток 20,0-30,0 млн/см³. До температуры -70°С суспензию клеток охлаждают со скоростью 2°С/мин, до температуры -150°С - 10°С/мин, затем ампулы помещают в жидкий азот (-196°С). Размораживание производят в температурном диапазоне 39-42°С в течение 2 мин. Жизнеспособность клеток после криоконсервирования на первом пассаже составляет 85-90%, затем увеличивается до 96-99%. После реконсервации клеток и выращивания непосредственно в суспензии (в ферментере) в течение первого пассажа происходит задержка пролиферации на сутки.

Описание способа получения сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве исходного материала использовали перевиваемую монослойно-суспензионный линию клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 2-17b, полученную во ВНИЯИ в 1986 г. [4, 5]. Данная клеточная сублиния применялась в качестве производственной в течение 10-12 пассажей для получения суспензий с концентрациями клеток 3,5-4,0 млн клеток/см³. Для культивирования данных клеток была разработана ростовая среда оригинального состава (таблицы 1 и 2), содержащая 5% сыворотки крови КРС, 15-20 см³/дм³ гидролизата белков крови, 2-10 см³/дм³ перевара по Хоттингеру, 8 протеиногенных аминокислот (L-аргинин, L-глутамин, L-изолейцин, L-метионин, L-тирозин, L-треонин, L-триптофан, L-цистеин), глюкозу, комплекс витаминов и минеральных солей.

Клетки многократно подвергали криоконсервации с последующим размораживанием и выращиванием в данной ростовой среде до 13 пассажа. Для криоконсервирования применяли криосреду, представляющую собой ростовую среду (таблица 1) с добавлением 7-10% этиленгликоля и 20% фетальной сыворотки КРС.

В течение 30 лет клеточная сублиния ВНК-21/2-17b прошла около 100 пассажей и преобразовалась в новую сублинию ВНК-21/SUSP/ARRIAH, клетки которой отличаются однообразием морфологии и размера с высокой пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 6,67-11,00) и количеством жизнеспособных клеток 96-99%.

Клеточная сублиния прошла контроль на стерильность согласно ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Морфологические исследования клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b.

Перевиваемая клеточная сублиния ВНК-21/2-17b более 30 лет культивировалась в суспензионных условиях без монослойной стадии. Перемежающиеся заморозки в больших ампулах объемом 100 см3 позволяли поддерживать популяции клеток в активном состоянии, без снижения пролиферативной активности (кратность прироста не менее 4-6) благодаря использованию ростовой среды модифицированного состава (таблицы 1, 2).

На фиг. 3 показано морфологическое состояние клеток сублинии ВНК-21/2-17b на момент патентования (1986 г.). Морфология клеток была определена как аморфная, иными словами, при посеве на субстрат в первом пассаже клетки не имели постоянной формы, активно перемещались и только во время деления приобретали сферическую форму. На втором пассаже клетки данной сублинии полноценно адгезировались и принимали эпителиоподобную форму. После полного покрытия субстрата часть клеток переходила в суспензионное состояние (фиг. 4) и характеризовалась высокими показателями пролиферативной активности (кратность прироста составляла не менее 4-6).

В результате суспензионного культивирования в производстве клетки перевиваемой сублинии ВНК-21/2-17b были подвержены около 100 последовательным пассажам в ростовой среде модифицированного состава (таблицы 1, 2). При этом монослойная стадия наработки данной культуры клеток не применялась. В результате была получена новая суспензионная клеточная сублиния ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Морфология суспензионных клеток выведенной сублинии представлена на фиг. 8. По итогам морфологического анализа видно, что внешне клетки практически не меняются по сравнению с сублинией ВНК-21/2-17b. В популяции преобладает доля мелких клеток размером 8-10 мкм (до 90%). При этом в процессе пассирования на горизонтальной поверхности клетки слабо адгезируются (исключение составляют полиплоиды) и интенсивно перемещаются. В результате многократных митотических делений наблюдается значительное увеличение концентрации клеток в культуральном флаконе в суспензионном состоянии. Иными словами, созданная клеточная линия ВНК-21/SUSP/ARRIAH представляет собой исключительно суспензионную клеточную сублинию.

Для оценки размера ядра относительно цитоплазмы проводили обработку суспензионных клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH акридиновым оранжевым. Для анализа проводили отбор 50 образцов клеточных суспензий новой сублинии после выращивания клеток в стеклянных и металлических реакторах. В результате экспозиции с акридиновым оранжевым ядра приобретали яркое зеленовато-желтое окрашивание и были визуализированы на оранжевом фоне цитоплазмы (фиг. 9). По итогам измерений диаметров ядер и клеток пришли к выводу о том, что для новой сублинии отмечается увеличение размера ядра относительно цитоплазмы и размера клетки. В некоторых случаях размер ядра составлял 60-80% от объема клетки.

Пример 2. Кариологическое исследование клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипной линией ВНК-21/2-17b.

Кариологическое исследование сублинии клеток

ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b проводили с применением метода Moorhead и др. [8]. После получения препарата с метафазными пластинками, производили фотографирование 100 метафазных пластинок, их подсчет и составление кариограммы.

На фиг. 2 показан популяционный состав культуры клеток ВНК-21/2-17b на момент патентования в 1986 г. Многократные опыты указывали на стабильное преобладание популяций с 42 хромосомами (28-40% от всей популяции).

В течение трех десятилетий в производстве монослойная стадия наработки данной культуры клеток не применялась. В результате суспензионного культивирования в ростовой среде модифицированного состава (таблицы 1, 2) в течение около 100 последовательных пассажей клетки ВНК-21/2-17b трансформировались в новую клеточную сублинию ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Популяции клеток данной линии, выращенных в стеклянных и металлических культиваторах объемом 50, 1000 и 2000 дм соответственно, подвергали кариологическому анализу. Для исследования использовали по 50 образцов клеточных суспензий, полученных через 48 ч после посева. По итогам анализа выяснили, что в однородных условиях культивирования в клетках произошли некоторые кариологические изменения. Модальный класс новой сублинии стал равен 41 хромосоме и соответствует 32-40% популяции. Доля клеток с количеством хромосом 40-42 составляет 78-80%), полиплоидов - в среднем около 1%. Пределы изменчивости хромосомного набора для клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH соответствуют диапазону от 36 до 54 хромосом. Наличие 36 хромосом отмечают у 0-1% популяций, 37 хромосом - у 0-4%, 38 хромосом - у 2-9%, 39 хромосом - у 3-11%, 40 хромосом - у 8-24%, 42 хромосомы - у 15-27%, 43 хромосомы - у 6-12%, 44 хромосомы - у 2-3%, 46 хромосом - у 0-2% и 52-54 хромосом - у 0-2% (фиг. 5-7).

Сравнивая все кариограммы можно сделать вывод, что при суспензионном культивировании в указанных выше условиях происходит селекция полученной клеточной сублинии в направлении гипоплоидии, при этом модальный класс не опускается ниже 41 хромосомы.

Пример 3. Цитометрические исследования клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH для анализа клеточного цикла в сравнении с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b.

Для сравнительного анализа фаз жизненного цикла клеток сублиний ВНК-21/SUSP/ARRIAH и ВНК-21/2-17b (наиболее близкий прототип) провели цитометрические исследования на проточном цитометре «Accuri С6» с помощью набора для определения ДНК клеток «С6 Flow Cytometer Fluid Kit» (N=22). ДНК-гистограммы для клеток сублиний ВНК-21/SUSP/ARRIAH и ВНК-21/2-17b через 48 ч после пересева клеточной суспензии представлены на фиг. 10 и в таблице 4.

Из сведений, отраженных на фиг. 10, и средних значений таблицы 4 видно, что у прототипной линии ВНК-21/2-17b клеток в состоянии апоптоза и дебриса было 51,0-60,0%, что на 31,0-5,0%) больше, чем у клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH (20,0-55,0%). В G1-фазе (пресинтетический период) находилось 30,0-75,0% клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH и 28,0-70,3% клеток сублинии ВНК-21/2-17b. Во время данной фазы клетки указанных линий подготавливаются к удвоению хромосом, отмечается интенсивный полипептидов, увеличивается количество митохондрий и рибосом. В данной стадии клетки новой сублинии находятся на 2,0-4,7%) в большем количестве по сравнению с прототипным вариантом.

Следует отметить, что, вероятно, у сублинии ВНК-21/2-17b часть клеток между митотической фазой М и началом S-фазы переходит в стадию апоптоза, что, соответственно, в дальнейшем сказывается на кратности прироста всей клеточной популяции.

В стадии S-фазы (синтетический период), когда наблюдается репликация клеточной ДНК во многих репликонах, и начинается удвоение центриолей в клеточном центре, у сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH находится 2,0-33,0% клеток, а у прототипной линии - 1,5-30,0%», что на 0,5-3,0% выше по сравнению с клетками новой сублинии.

В 02-фазе (постсинтетический период), во время которой накапливаются энергия, белки для митотического деления клетки и достигается тетраплоидный набор ДНК, а также в М-фазе (митоз) через 48 ч у сублинии ВНК-21/2-17b находится 2,6-18%) клеток, а у ВНК-21/SUSP/ARRIAH - 3,0-20% клеток, что на 0,4-2,0% выше и свидетельствует о большем потенциале клеток новой сублинии для продолжения деления.

Таким образом, в результате суспензионного культивирования в ростовой среде модифицированного состава в течение 100 последовательных пассажей клетки перевиваемой линии ВНК-21/2-17b трансформировались в новую сублинию ВНК-21/SUSP/ARRIAH, для которой, вероятно, произошла селекция основной популяции, что проявилось в снижении количества клеток, находящихся в стадии апоптоза и дебриса на 31,0-5,0%, и в увеличении числа клеток, участвующих в G1-, S- и G2+М-фазах на 2,0-4,7, 0,5-3,0, 0,4-2,0%), соответственно, обеспечивающих клеточный рост.

Пример 4. Оценка ростовых свойств клеток су 6 линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипными сублиниями.

Клетки су 6 линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, полученные в результате длительного суспензионного культивирования (около 100 пассажей) в ростовой среде модифицированного состава (таблицы 1, 2) исследовали на оценку ростовых свойств в сравнении с клетками прототипных сублиний ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13. Результаты анализа представлены в таблице 5 и на фиг. 1.

Из данных таблицы 5 видно, что при суспензионном культивировании клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH отъемно-доливным способом, раздельными циклами по 10-12 пассажей, при посевной концентрации 0,5-0,6 млн клеток/см через 48 часов культивирования в оптимальном режиме концентрация составляет 4,0-5,5 млн клеток/см³. Таким образом, кратность прироста равна 6,67-11,00 при жизнеспособности клеток 96-99%. Отмечается экспоненциальный характер роста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензионном состоянии с затуханием пролиферации после 48 часов культивирования (фиг. 1).

Суспензионные клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при выращивании в культуральных флаконах в статичных условиях характеризуются низкими показателями адгезии, имеют аморфную форму с множеством цитоплазматических выростов, динамика которых составляет несколько минут.

Таким образом, в сравнении с прототипами клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при суспензионном выращивании имеют большую кратность прироста на 0,67-3,00 с сохранением жизнеспособности клеток на 96-99%.

Пример 5. Репродукция вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в клетках сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипными сублиниями.

В клетках перевиваемой суспензионной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH провели репродукцию вируса ящура штаммов А/Турция/2006 (N=100), O/PanAsia-2 (N=100), Азия-1/Таджикистан/2011 (N=80), вируса бешенства штаммов ВНИИЗЖ (N=40) и РВ-97 (N=40), вируса болезни Ауески штаммов ВК (N=40) и К (N=40), вируса парагриппа-3 КРС штамма ВГНКИ-4 (N=50) с целью получения вируссодержащего сырья для изготовления противовирусных вакцин.

Результаты культивирования указанных вирусов представлены в таблице 6 и проведен сравнительный анализ с данными для прототипных клеточных сублиний ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13. Из таблицы 6 следует, что вирус ящура в клетках сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 95-99% с титрами инфекционной активности 7,30±0,13 - 8,00±0,21 lg ТЦД₅₀/см³ (N=280) (в аналогах, с использованием культур клеток ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13, - до 7,00 lg ТЦД₅₀/см³).

С помощью метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции [9] определяли концентрацию иммуногенного 146S компонента вируса ящура после репродукции в полученной сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая в среднем составила 1,95±0,32 мкг/см³ с 1,00 млн клеток. При использовании культуры клеток ВНК-21/13-02 (аналог) количество иммуногенных компонентов составляло до 1,00 мкг/см³, а клеток сублиний ВНК-21/13-13и ВНК-21/2-17b (аналоги) до 1,50 мкг/см³ с общей популяции клеток.

При репродукции вируса бешенства в полученной сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH - ЦПД составило 95-99% с титрами инфекционности - 8,25±0,20 - 8,50±0,13 ЛД₅₀/см³ (N=100), а в аналогах, с использованием культуры клеток ВНК-21/13-02 - 6,50 ЛД₅₀/см³, с ВНК-21/2-17b и ВНК-21/13-13 - до 8,00 ЛД₅₀/см³. Вирус болезни Ауески при культивировании в клетках сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH вызывал ЦПД у 95-97% клеток с накоплением 7,50±0,19 - 7,80±0,15 lg ТЦД₅₀/см³ (N=80), а вирус парагриппа-3 КРС обеспечивал ЦПД клеток на 95-98%) с титром инфекционной активности до 6,00±0,15 lg ТЦД₅₀/см³ (N=50).

Таким образом, клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, полученной для производства противоящурных вакцин а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов, позволяют проводить репродукцию вируса ящура с титром на 1,00 lg ТЦД₅₀/см³ выше (до 8,00±0,21 lg ТЦД₅₀/см³) и концентрацией иммуногенных компонентов в 2-3 раза выше (до 1,95 мкг/см³ с 1 млн клеток) по сравнению с аналогами (не более 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ и 1,50 мкг/см³ со всей популяции клеток). Предложенная сублиния обеспечивает накопление вируса бешенства с титром на 0,50 lg ЛД₅₀/см³ (до 8,50±0,13 lg ЛД₅₀/см³) выше по сравнению с прототипными линиями (не более 8,00 lg ЛД₅₀/см³), а также получать вирусы парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в количествах 6,00±0,15 и до 7,80±0,15 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно.

Пример 6. Оценка жизнеспособности клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, рекультивированных после криоконсервирования.

Криоконсервирование суспензии клеток полученной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в производственных условиях проводят в ампулах объемом 100 см³ в криосреде (ростовая среда (таблица 1) с добавлением 7-10%) этиленгликоля и 20%>фетальной сыворотки КРС). До температуры -70°С суспензию клеток охлаждают со скоростью 2°С/мин, до температуры -150°С - 10°С/мин, затем ампулы помещают в жидкий азот (-196°С), предварительно подержав над парами азота. Размораживание клеточной суспензии осуществляют при температуре 39-42°С в течение 2 мин. Жизнеспособность клеток после криоконсервирования на первом пассаже составляет 85-90%, со второго пассажа увеличивается до 96-99%. После реконсервации клеток и выращивания непосредственно в суспензии (в ферментере) в течение первого пассажа происходит задержка пролиферации на сутки. На фиг. 11 показана кратность прироста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 12 последовательных пассажей после криоконсервации. Данное исследование проводили в 30 повторностях. Интенсивность пролиферации на первом-третьем пассажах после криоконсервирования варьировала от 3,36±0,21 до 5,88±0,15 (р<0,005). Начиная с четвертого пассажа значения кратности прироста составляли от 6,85±0,18 до 10,95±0,31 (р<0,005).

Таким образом, клеточная сублиния ВНК-21/SUSP/ARRIAH быстро рекультивируется после криоконсервирования и отличается высокими пролиферативными показателями (до 10,95±0,31) с жизнеспособностью клеток 95-99%о.

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является новая перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая предназначена для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС, болезни Ауески с большим накоплением антигена для производства противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.

Предлагаемое изобретение отличается высокими показателями пролиферативной активности клеток полученной сублинии, существенными изменениями кариологических показателей и селекцией в направлении гипоплоидии с 41 хромосомой в модальном классе. В предлагаемом изобретении отмечается снижение количества клеток, находящихся в стадии апоптоза, на 31,0-5,0% и увеличение доли клеток, участвующих в обеспечивающих клеточный рост G1-, S- и G2+М-фазах, на 2,0-4,7, 0,5-3,0, 0,4-2,0%, соответственно.

Предлагаемое изобретение отличается высокой кратностью прироста клеток 6,67-11,00 с сохранением жизнеспособности клеток на 96-99%, начиная со второго пассажа рекультивации после криоконсервирования.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «ВНК-21/SUSP/ARRIAH - перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.»:

1. Stoker М., Macpherson I.A. Syrian hamster fibroblast cell line BHK-21 and its derivaties // Nature. - 1964. - V. 203. - P. 1355-1357.

2. Юрков С.Г., Зуев В.В. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ - Покров. - 2000. - С. 60.

3. Юрков С.Г., Зуев В.В. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ - Покров. - 2000. - С. 61.

4. Сокова В.В., Алеева Л.А., Бондаренко А.Ф., Худяков Г.А, 1988. Авторское свидетельство СССР №240289, 1986.

5. Юрков С.Г., Зуев В.В. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ - Покров. - 2000. - С. 62.

6. Патент РФ №2614074, 22.03.2017. ВНК-21/13-02-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства // Патент России №заявки 2005116301/2017.03.22. Бюл. №9 / Елисеев А.К., Мельник Н.А., Зенов Н.И. [и др.].

7. Патент РФ №2553552, 01.08.2014. ВНК-21/13-13-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства // Патент России №заявки 2014131866/10/2014.08.01. МПК C12N / Елисеев А.К., Зенов Н.И., Красуткин С.Н. [и др.].

8. Moorhead P.S. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral Blood / P.S. Moorhead, P.C. Nowell, W.J Mellman et al. // Exper. Cell. Res. - 1960. - V. 20. - P. 613-616.

9. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Патент России №2016140460/15. 2017. Бюл. №14 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к перевиваемой суспензионной сублинии клеток почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARPJAH. Линия клеток предназначена для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов и задепонирована в Специализированной коллекции культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» Института цитологии РАН 23.04.2019 под номером РККК(П) 797 Д. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 6 табл., 6 пр.

1. BHK-21/SUSP/ARRIAH - перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов, отличающаяся тем, что депонирована в Специализированной коллекции культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» Института цитологии РАН 23.04.2019 под номером РККК(П) 797 Д.

2. Сублиния клеток по п. 1, отличающаяся тем, что получена из клеточной линии ВНК-21/2-17b путем перманентного суспензионного культивирования в течение 100 пассажей, минуя монослойную стадию, в ростовой среде оригинального состава, содержащей 5% сыворотки крови КРС, 15-20 см³/дм³ 10%-ного гидролизата белков крови, 2-10 см³/дм³ 10-ного перевара по Хоттингеру, 8 протеиногенных аминокислот (L-аргинин, L-глутамин, L-изолейцин, L-метионин, L-тирозин, L-треонин, L-триптофан, L-цистеин), глюкозу, комплекс витаминов и минеральных солей.

3. Сублиния клеток по п. 1, отличающаяся тем, что при суспензионном культивировании проходит селекцию в направлении гипоплоидии:

- модальный класс соответствует 41 хромосоме (32-40% клеток);

- доля клеток с количеством хромосом 40-42 составляет 78-80%;

- доля полиплоидов - в среднем около 1%;

- пределы изменчивости хромосомного набора соответствуют диапазону от 36 до 54 хромосом.

4. Сублиния клеток по п. 1, отличающаяся тем, что при суспензионном культивировании отъемно-доливным способом с раздельными циклами по 10-12 пассажей отмечается экспоненциальный характер роста клеток с затуханием пролиферации после 48 часов, с кратностью прироста - 6,67-11,00 при жизнеспособности клеток 96-99%.

5. Сублиния клеток по п. 1, отличающаяся тем, что при выращивании в статичных условиях клетки суспензии проявляют низкие адгезивные свойства, имеют аморфную форму с множеством цитоплазматических микровыростов и в процессе митотического деления накапливаются в культуральной среде во взвешенном виде (в суспензии).

6. Сублиния клеток по п. 1, отличающаяся тем, что в клеточном цикле популяции через 48 ч преобладает G1-фаза, на которую приходится 30,0-75,0% клеток. В фазах подготовки к митозу и митотического деления (G2+М-фазы) находится от 3,0 до 20,0% всей популяции. Количество крупноядерных и многоядерных клеток (>4n) в начале и в конце стадии логарифмического роста увеличивается до 2%.

7. Сублиния клеток по п. 1, отличающаяся тем, что клетки быстро восстанавливаются после криоконсервирования с жизнеспособностью 95-99%, с кратностью прироста 3,36-5,88 на 1-3 пассажах и 6,85-10,95 с 4 по 12 пассажи.

8. Сублиния клеток по п. 1, отличающаяся тем, что позволяет проводить репродукцию следующих вирусов:

- вируса ящура с титрами 7,30-8,00 lg ТЦД₅₀/см³ и количеством иммуногенных компонентов 0,50-1,95 мкг/см³ с 1,00 млн клеток;

- вируса бешенства с титрами 8,25-8,50 lg ЛД₅₀/см³;

- вируса парагриппа-3 КРС с титром 6,00 lg ТЦД₅₀/см³;

- вируса болезни Ауески с титрами 7,50-7,80 lg ТЦД₅₀/см³.