СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК Российский патент 2003 года по МПК C07K16/42 A61K39/42 

Область техники: биология, медицина, биотехнология, иммунология, иммунофармакология, звероводство
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Алеутская болезнь норок (АБН) - видоспецифичный приобретенный вирусный иммунодефицит. В определенной степени АБН гомологична синдрому приобретенного вирусного иммунодефицита человека. АБН является высококонтагиозным заболеванием, распространяемым, в основном, с кормом и водой и практически полностью поражающим стадо норок при занесении инфекции в зверохозяйство. АБН приводит к резкому сокращению плодовитости и значительному росту падежа животных, связанному, в частности, с поражением почек у больных животных.

Способов лечения и профилактики АБН в настоящее время не имеется и с распространением болезни борются с помощью уничтожения зараженного поголовья животных и сжигания использовавшегося инвентаря.

Соответственно, целесообразность внедрения в звероводческую практику эффективного способа профилактики АБН очевидна и не требует специального обоснования.

Кроме того, принимая во внимание выраженное сходство приобретенных вирусных иммунодефицитов - АБН норок и СПИД человека, разработка и апробация эффективной профилактической вакцины против АБН может стать важным шагом в получении профилактической вакцины "Анти-СПИД".

Важно, что современная теоретическая иммунология и иммунобиотехнология создают предпосылки для разработки простых и эффективных способов получения вакцинных препаратов, основанных на подмене вирусных антигенов (получение которых как правило дорого, сложно, трудоемко, а в некоторых случаях опасно для здоровья) их более дешевыми и безопасными аналогами. В качестве таких аналогов теоретически могут быть использованы специфические антиидиотипические антитела (АИАТ) или их Fab-фрагменты (Fаb2-фрагменты), в силу "молекулярной мимикрии" являющиеся иммунохимическими аналогами вирусных антигенов.

В основу данного патента легли результаты экспериментов, в которых проверялась возможность того, что АИАТ, либо Fab-фрагменты АИАТ, полученных на антивирусные антитела (вырабатываемые на вирусные частицы у норок, больных АБН), могут реально применяться в качестве вакцины, пригодной для профилактики АБН.

Аналогов описанного способа не имеется.

В качестве прототипа данного изобретения можно рассматривать теоретические работы, описывающие потенциальную возможность применения АИАТ, соответствующей специфичности для лечения бактериальных и вирусных инфекций (Kingman, New Sci., 1989, 121, 1650, 30; Monroe a. Greene, Immunol. Investigations, 1986, 15, 3, 263-286). Отметим, что подобные теоретические работы пока не вышли за пределы исследовательских лабораторий.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Получение микроколичеств вирусных антигенов, являющихся мишенями антител у животных, больных АБН.

По общепринятым методам (например, с помощью комбинации осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе) получают суммарные фракции иммуноглобулинов из сыворотки крови норок, больных АБН и здоровых норок.

Готовят экстракты почек больных и здоровых животных, гомогенизируя ткани в экстрагирующем водно-солевом буфере (например, на основе 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,5 с 0,3 М NaCl и 0,05% тритона Х-100), центрифугируют для осветления и фильтруют для устранения микрочастиц.

Попарно (раздельно) смешивают экстракты почек здоровых норок и больных норок с растворами иммуноглобулинов крови здоровых и больных норок и добавляют агент, стимулирующий образование антигенантительных комплексов (например, полиэтиленгликоль-6000) и проводят инкубацию полученных смесей (10-24 час при+2...+8^oС).

Центрифугируют смеси для получения осадка преципитатов. Отмывают преципитаты экстрагирующим буфером, растворяют их и проводят электрофоретическое разделение материала преципитатов в полиакриламидном геле по общепринятым способам.

С помощью анализа электрофореграмм преципитатов, полученных с использованием иммуноглобулинов и экстрактов почек больных и здоровых норок, выявляют и вырезают из геля зоны, встречающиеся только в преципитатах почках норок, больных АБН и осаждаемые только иммуноглобулинами (антителами), выделенных из крови больных животных. Таким способом получают микроколичества "мажорных" антигенов вирусов АБН, на которые происходит выработка основных антивирусных антител иммунной системой больных животных.

2. Получение антивирусных антител из крови норок, больных АБН.

Вирусные антигены, идентифицированные в электрофореграммах иммунопреципитатов, как описано выше, экстрагировали из гелей и иммобилизовывали на инертных носителях для аффинной хроматографии (например, на CNBr-сефарозе, согласно инструкции фирмы-изготовителя "Pharmacia", Швеция).

Полученные носители с иммобилизованными вирусными антигенами, переносили в хроматографические микроколонки (по 0,5 мл) и пропускали через них по 2-5 мл сыворотки крови норок, больных АБН. После отмывания колонок от несвязавшегося материала, проводили элюцию противовирусных антител, связавшиеся с иммобилизованными вирусными антигенами (например, 3 М раствором NaSCN), и проводили их диализ против любого нейтрального буферного раствора.

Для устранения возможных примесных материалов полученные антитела пропускали через колонки с иммобилизованными антигенами экстрактов почек здоровых норок.

Очищенные антивирусные антитела подвергали гидролизу по общепринятым способам для получения их F(аb)-фрагментов или F(аb)2-фрагментов.

3. Получение специфических антиидиотипических антител, используемых в качестве вакцинного препарата.

Полученными F(аb)-фрагментами или F(аb)2-фрагментами норочьих антивирусных антител иммунизировали кроликов по общепринятым схемам. По завершении иммунизации от животных получали гипериммунные сыворотки.

Из полученных гипериммунных сывороток выделяли антиидиотипы, специфически взаимодействующие с F(аb)-фрагментами норочьих антител к антигенам вирусов АБН, используя иммуноаффинную сорбцию (по общепринятым схемам) на колонках с иммобилизованными иммуноглобулинами норок, больных АБН.

Для устранения возможных примесей балластных "антивидовых" антител первичный антиидиотипический препарат пропускали через колонку с иммобилизованными очищенными иммуноглобулинами из сыворотки здоровых норок.

Полученный антиидиотипический препарат использовали в качестве профилактической вакцины для предотвращения заболевания АБН.

В части случаев в качестве вакцинного препарата применяли F(ab)- или F(ab)2-фрагменты антиидиотипов, полученные по общепринятым схемам.

3. Профилактическая вакцинация.

Профилактическая эффективность полученных вакцинных препаратов испытывали на молодняке темно-коричневых норок. Эксперименты проводились на зараженной АБН популяции животных в племенном зверосовхозе "Коткозерский" Олонецкого р-на Республики Карелия.

Для вакцинации отбирались животные без видимых клинических симптомов АБН. Все они получали по 3 последовательных инъекции (с 10-дневными интервалами между введениями) одного из вариантов вакцинных препаратов. Препараты вводились подкожно, по 2-3 мг суммарного белка, сорбированного на суспензии гидроокиси алюминия.

Использовались следующие вакцинные препараты (каждый вариант вакцинации проверялся на 50 животных; контрольная группа - 600 животных):
- VS30 - цельные антиидиотипические аналоги вирусного белка с молекулярной массой 30 кД;
- VS80 - цельные антиидиотипические аналоги вирусного белка с молекулярной массой 80 кД;
- VS30+VS80 - смесь цельных антиидиотипических аналогов вирусного белка с молекулярной массой 30 кД и аналогов вирусного белка с молекулярной массой 80 кД;
- VF80 - Fab-фрагменты антиидиотипических аналогов вирусного белка с молекулярной массой 80 кД.

На протяжении последующих 4 месяцев сравнивали уровень падежа среди невакцинированных животных и норок той же популяции, вакцинированных разными препаратами. Кроме того оценивали наличие или отсутствие симптомов АБН у животных визуально и по результатам вскрытия (по заключению ветеринарного врача зверосовхоза). Примеры (результаты) - см. таблицу в конце текста.

ВЫВОДЫ:
1. Вакцинные антиидиотипические препараты VF80 и VS80 эффективно предотвращают развитие приобретенного вирусного иммунодефицита - алеутской болезни норок не менее чем у 80-90% вакцинированных животных, причем наиболее эффективно оказывается использование препарата VF80, представленного Fab-фрагментами антиидиотипических аналогов вирусного белка с молекулярной массой 80 кД.

2. На примере (экспериментальной модели) создания нового способа профилактики алеутской болезни норок отработана принципиальная схема получения и доказана практическая эффективность противовирусных вакцинных препаратов, полученных на основе антиидиотипических аналогов вирусных антигенов. Разработанный способ потенциально может быть эффективным для создания профилактических вакцин против СПИД, вирусного гепатита и др. вирусных заболеваний человека и животных.

3. Применение профилактической антиидиотипической вакцины против алеутской болезни норок не менее чем в 3-4 раза снижает заболеваемость и падеж животных и может эффективно использоваться в условиях специализированного звероводческого хозяйства, пораженного алеутской болезнью.

Изобретение относится к биологии, медицине, иммунологии, биотехнологии, иммунофармакологии, звероводству. Целью изобретения является получение вакцинного препарата для профилактики приобретенного вирусного иммунодефицита - алеутской болезни норок. Эта цель достигается за счет применения в качестве вакцинного препарата антиидиотипических антител или их F(ab)-фрагментов, являющихся иммунохимическими аналогами ("мимикрирующих") основных антигенов вирусов алеутской болезни норок. Технический результат - снижения заболеваемости и падежа норок в 3-4 раза. 1 табл.

Способ специфической профилактики алеутской болезни норок, отличающийся тем, что проводят парентеральное введение норкам антиидиотипических антител или их F (ab)-фрагментов, являющихся аналогами антигенов-мишеней вируса-возбудителя.