Способ получения конъюгатов ферментов и антител для иммуноферментного анализа Советский патент 1988 года по МПК G01N33/53 

4

ЬО СО

ю

О5

i Изобретение относится к медицине, /а. именно к биоорганической химии, и сается способа получения конъюгатов 1ферментов и антител для иммунофермент :ного анализа.

Целью изобретения является сокра- :щение времени получения целевого про- :дукта.

Способ осуществляют следующим об- |разом.

I Конъюгацию ферментов с антителами по предлагаемому методу проводят в воде либо в 0,15 М NaCl при рН А.,0

,0, добавляя раствор соли переходно-15 повторяли трижды.

го металла () . Реакционную смесь перемешивают 5-20 мин, после чего диализуют против 0,15 М NaCl. За реакцией следят, отбирая аликвоты реакционной смеси ( 2 мкг антител), и наносят их в лунки планшета для иммунологического анализа, покрытые предварительно антигеном. После инку3. Внесение в планшет конъюгата (антител, меченых ферментом). Конъю- гат вносили по 200 мкл в лунки планшета. Начальное разведение конъюгата 20 бьшо 1:25 с последующим шагом 2. Инкубация в течение 1 ч при 37 С. 4. Отмывка планшета (см. п. 2). .5. Внесение субстратной смеси. Субстратной смесью для ЩФ является

бации в течение 1 ч и промывки 0,01 М

фосфатным буфером, содержа1 м 0,15 М 25 10 мМ раствор паранитрофенилфосфата

в 1 М диэтилоламине, рН 9,8. Субстратную смесь в объеме 200 мкл вносиИкубация

Nad и 0,05% твин-20, непосредственно определяют ферментативную активность сорбированного конъюагата.

Пример 1. А. Синтез конъюге- та щелочной фосфатазы и антител с по- Ьо мощью Сг.

К 250 мкг щелочной фосфатазы (1ДФ) тюленя (удельная активность 1200 ед на 1 мкг белка), растворенной в , : 250 мкл 0,15 М NaCl, содержащем 0,01 Мзз : MgCl-, (рН 9,0) прилили 21 мкл антител против IgG человека с концентрацией 6 мг/мл, находящихся в растворе 0,15 М NaCl, и 19 мкл 3%-иого раствора . Конечная концентрация Сг составила 40 2 мг/мл. Реакция протекала при комнатной температуре 20 мин. Реакцион- на я смесь .была диализована против 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,001 М MgCl в течение 2 ч при ком- натной температуре. Полученный конъю- гат был разведен в 10 раз 0,02 М трис-НС буфером, 0,01 М MgCl2, 5% альбумина сыворотки человека (USA) рН Ь,0, содержащим 0,01X NaNj.

Б, Постановка реакции энзим-меченых антител (РЭМА) с полученным конъ- югатом.

ли в каждую лунку планшета,

при комнатной температуре в течение

45 мин. . -

1 М NaOH.

в лунках с иммобилизованными IgG была Сд , , что соответствует 190 нг, в то время как в лунках с иммобилизованными BSA ОдЕ4о5 0,15, что соответствует 30 нг.

Подбор проводился в опытах с небольшим количеством белков. В каждую лунку вносили 20 мкл ЩФ с концентрацией 40 мкл/мл, 20 мкл антител к IgG с концентрацией 20 мкл/мл и 10 мкл раствора Сг в таких концентрациях, чтобы конечная концентрация ионов

дую фазу. В лунки микротитровального хрома в реакционной смеси бьша соотпланшета вносили по 200 мкл раствораветственно 1, 2, 3, 4 и 5 мг/мл. антигена с концентрацией белкаРеакционную смесь инкубировали

20 мкг/мл в OB01 М карбонатном буфе-40 мин при комнатной температуре.

ре (рН 9,6} и инкубировали в течениеЗатем содержимое каждой лунки (50 мкл)

0262

4 ч при комнатной температуре. После инкубации планшеты отмывают от несвязавшегося антигена. В качестве конт- роля вместо антигена использовали бычий сывороточный альбумин (BSA).

2, Отмывка планшетов. Содержимое лунок удаляли и планшеты тщательно отмывали от неприсоединившегося белка Q струей водопроводной воды. Затем лунки заполняли отмывающей жидкостью (водопроводная вода, содержащая 0,05% твина-20) и вновь споласкивали водопроводной водой. Процедуру отмывания

повторяли трижды.

Икубация

ли в каждую лунку планшета,

при комнатной температуре в течение

45 мин. . -

1 М NaOH.

в лунках с иммобилизованными IgG была Сд , , что соответствует 190 нг, в то время как в лунках с иммобилизованными BSA ОдЕ4о5 0,15, что соответствует 30 нг.

Подбор проводился в опытах с небольшим количеством белков. В каждую лунку вносили 20 мкл ЩФ с концентрацией 40 мкл/мл, 20 мкл антител к IgG с концентрацией 20 мкл/мл и 10 мкл раствора Сг в таких концентрациях, чтобы конечная концентрация ионов

переносили в лунку с предварительно иммобилизованным антигеном. Инкубировали 1 ч при 37 С. Отмывали планшет и вносили субстратную смесь.

Оптимальная концентрация соли Сг соответствовала наибольшей оптической плотности и составила 2 мг/мл.

Пример 2. А. Получение конъюгата глюкозооксидазы и антител Q с помощью Сг .

К 500 мкл очищенной глюкозооксидазы с концентрацией 4 мг/мл, находящейся в 0,15 М Nad (рН 7,0), прилили

tech auto Ehsareader при длине волн 492 нм. В результате реакции получа ли, что оптически плотность в лунка с иммобилизованными IgG бьша D 49 1,0, что соответствует 180 нг дос тавленного на планшет фермента, в т время как в лунках с иммобилизованн ми BSA 0,08, что соответствуе 5 нг фермента.

В. Определение степени связывани фермента с антителами при приготовл нии конъюгата. .

На колонку с IgG наносили конъю

250 мкл антител к IgG с концентраци.- 15 г ат глюкозооксидазы антителами к

20

ей 4 мг/мл в 0,15 М NaCl и раствора СгС1з до конечной концентрации 5 мг/мл.

Реакция протекала при комнатной температуре 20 мин, после чего полученный конъюгат бьш отдиализован против 0,15 М Nad в течение 2 ч при комнатной температуре.

Б. Постановка РЭМА с полученным конъюгатом.

о

35

37 С, а затем отмывка планшета от несвязавшегося белка.

1 мг пероксидазы растворяли в 20 мл фосфатно-солевого буфера (рН 7,4). Субстратную смесь в объеме 150 мкл вносили в каждую лунку планшета. Инкубировали при комнатной температуре в течение 7 мин.

Пример 3. А. Синтез конъюгата пероксидазы с антителами с помощью Сг .

К 300 мкл очищенной пероксидазы из хрена (с концентрацией 5 мг/мл, находящейся в 0,15.М NaCl, рН 4,0) прилили 150 мкл антител к IgG с кон центрацией 5 мг/мл в 0,15 М Nad (рН 4,0) и раствор .-СгС1з до конечно концентрации 4 мг/мл. Реакция проте кала 10 мин при комнатной температу ре, после чего полученный конъюгат был отдиализован против 0,15 М NaCl в течение 2 ч при Комнатной темпера туре.

Б. Постановка РЭМА с полученным конъюгатом. Постановка РЭМА осущест лялась так же, как описано в примерах 1 и 2. Субстратной смесью для п

роксидазы является ортофенилендиами растворенный в метиловом спирте. На 20 мл цитратного буферного раствора (рН 4,7) брали 200 мкл смеси орто- фенилендиамина + метанол и добавлял 2 мкл 30%-ной . Субстратную сме в объеме 100 мкл вносили в лунки планшета. Инкубировали при комнатно температуре 20 мин. Для остановки реакции к субстратной смеси добавля ли по 25 мкл 50%-ной серной кислоты Регистрация результатов проводилась путем измерений оптической плотност

40

45

50

55

Q

tech auto Ehsareader при длине волны 492 нм. В результате реакции получали, что оптически плотность в лунках с иммобилизованными IgG бьша D 49 1,0, что соответствует 180 нг доставленного на планшет фермента, в то время как в лунках с иммобилизованными BSA 0,08, что соответствует 5 нг фермента.

В. Определение степени связывания фермента с антителами при приготовлении конъюгата. .

На колонку с IgG наносили конъю15 г ат глюкозооксидазы антителами к

0

Q

5

IgG с активностью глюкозооксидазы, соответствующей 30 мкг очищенного фермента. В растворе, прошедшем через колонку, с помощью субстратной смеси, содержащей ортофенилендиамин,. и пероксидазу, определяли активность глюкозооксидазы. Сошедшая с колонки активность фермента соответствовала 12 мкг глю::озооксидазы. Сле- 5 довательно, при получении конъюгата в комплексе фермент-антитело связывается 60% фермента.

Пример 3. А. Синтез конъюгата пероксидазы с антителами с помощью Сг .

К 300 мкл очищенной пероксидазы из хрена (с концентрацией 5 мг/мл, находящейся в 0,15.М NaCl, рН 4,0) прилили 150 мкл антител к IgG с концентрацией 5 мг/мл в 0,15 М Nad (рН 4,0) и раствор .-СгС1з до конечной концентрации 4 мг/мл. Реакция протекала 10 мин при комнатной температуре, после чего полученный конъюгат был отдиализован против 0,15 М NaCl в течение 2 ч при Комнатной температуре.

Б. Постановка РЭМА с полученным конъюгатом. Постановка РЭМА осуществлялась так же, как описано в примерах 1 и 2. Субстратной смесью для п.ероксидазы является ортофенилендиамин, растворенный в метиловом спирте. На 20 мл цитратного буферного раствора (рН 4,7) брали 200 мкл смеси орто- фенилендиамина + метанол и добавляли 2 мкл 30%-ной . Субстратную смесь в объеме 100 мкл вносили в лунки планшета. Инкубировали при комнатной температуре 20 мин. Для остановки реакции к субстратной смеси добавляли по 25 мкл 50%-ной серной кислоты. Регистрация результатов проводилась путем измерений оптической плотности

0

5

0

5

субстратной смеси на Dynatech auto Ebjsareader при длине волны 492 нм. I I

В результате реакции получили,что оп -ическая плотность в лунках с иммо би|пизованным IgG была D432 , чт1о соответствует 220 нг достацленно- го) на планшет фермента, в то время ка|к в лунках с иммобилизованным BSA

92 , что соответствует 10 нг ффмента.

Время получения к-онъюгатов до удаления сшивающего агента составляет от 5 до 20 мин, в то время как в из14

вестном способе это время составляет 2ч.

Формула изобретения

10

Способ получения конъюгатдд ферментов и антител для иммуноферментно- анализа путем инкубации ферментов с антителами в присутствии сшивающего агента, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени получения целевого продукта, в качестве сшивающего агента используют хлорис- g тый хром, а инкубацию проводят с ан- тителами к IgG при рН 4,0-9,0.