Способ получения гликопротеина Советский патент 1988 года по МПК G01N33/50 

ы

Изобретение относится к медицине, а именно к получению гликопротеина.

Целью изобретения является повышение специфичности способа при получении гликопротеина, способного стимулировать образование гранулоцитов человека HGO-гликопротеин за счет обработки мочи методом хроматографии на силикагеле, СМ-сефадексе G-50 ДЕАЕ-целлюлозе, гель-фильтрации на Сефадексе G-150, адсорбции на конка- $алин А Сефароза 4В с последующей (Ьчисткой с помощью зонного электрофореза .

Способ осуществляют следующим об- разом..

; Свежую мочу, собранную от нормаль- людей, доводят до рН 6-9, пред Аочтительно 7-8, разбавленными раство ами кислоты или растворами щелочи и фатем центрифугируют для удаления не- |1астворимых примесей, содержащихся в моче. Верхний слой контактирует с Кремнийсодержащим адсорбентом, таким как силикагель, силикагель-силикат магния, диатомитбвая земля, кварц или бентонит, и адсорбированные составные Части элюируют щелочным раствором г редпочтительно при рН 9 или выше (щелочный раствор, который использу- и|)Т для элюации, не является специаль- , это предпочтительно водные раст- йоры гидроокиси аммония, гидроокиси 1|атрия и т.п. в концентрации 0,3- i,5 М). Затем доводят рН полученно- :tio элюата до 7-8 раствором кислоты rt добавляют нейтральную соль, например сульфат аммония, до 70% насьвдения и получают фракцию сырого протеина, содержащего НСЗ-гликопротеин.

Полученизло фракцию сырого протеина растворяют вновь в мало7й порции Щелочного раствора, освобождают от низкомолекулярных веществ ультрафильтрацией, разбавляют соляным буферным раствором и приводят в контакт с катионньм обменником например, карбоксимётилдекстраном,карбоксиметил целлюлозой или фосфоцеллюлозой для удаления примесей, содержащихся в растворе, в условиях нейтрального рН. Сырую фракцию НСЗ-гликопротеина катионнообменник доводят до рН 6- 8 предпочтительно 0,01-0,15 М соляными буферными растворами. Большая , часть HGD-гликопротеина проходит через катионный обменник без адсорбции. Концентрированный выходящий про

10

15

0 5 л

-

0

5

5

5

дукт уравнивают разбавленным буферным раствором с рН 6-8 и используют в ионно-обменной хроматографии с анионным обменником, например, ДЕАЕ- целлюлозой, который уравнивают таким же буфером, HGJ-гликопротеин адсорбируется на анионном обменнике. Затем адсорбированный HGj-гликопротеин элюируют методом градиентного линейного концентрационного элюирования с использованием 0,1-0,3 М соляных растворов, например хлорида натрия.

НСЗ-гликопротеин элюируют при концентрации соли от 0,1 М и вьше, но полное отделение затруднено. Отбирают фракции выходящего продукта при концентрации соли 0,1-0,3 М и при необходимости подвергают их обессо- ливанию и концентрационным обработкам. Для того, чтобы злюировать HGJ-гликопротеин из ионного обмен- ника, можно применять последовательное элюирование соляным раствором 0;1-0,3 М.

Для целей дальнейшей очистки объединенные фракции, полученные выше, очищают гель-фильтрационной хроматографией- на сильно сшитом полимерном геле, имеющем величину набухания в воде 10-20 мл/г, например Sepha. dex® G-150 или Biogel® Р-100 и активные вещества .извлекают 0,05- 0,1 М соляным буферным раствором, Фракции относительного объема выходящего продукта 1,11-1,60, предпочтительно 1,11-1,45 отбирают, обессо- ливают и концентрируют или лиофилизу- ют.

Пример 1. Доводят рН 400 л свежей мочи, собранной от нормальных людей, до 8 10%-ным раствором гидроокиси натрия и центрифугируют с помощью непрерьшного центрифугирования при 15000 об/мин при 0°С для удаления нерастворимых примесей. Доводят рН поверхностного слоя до 7 10%-ным раствором соляной кислоты и пропускают через колонку с силикаге- лем (10 X 80 см). Вещества, адсорбированные на колонке, элюируют 40 л 5%-ного раствора аммиака. Доводят.до рН злюированного раствора 7,5 1 н. серной кислотой, добавляют сульфат аммония до 70%-ного насыщения и отстаивают при О С в течение ночи. Осадок отфильтровывают, растворяют в 2 л 5%-ного раствора аммиака, помещают в целлофановые трубки и проводят диа31431691

ЛИЗ на фоне 0,05 М фосфатного буферно- го раствора (рН 6,5). Диализованный раствор доводят до 10 л таким же буферным раствором и пропускают через ионообменную колонку CM-Sephadex .G-50 (40x40 см), которая уравновешена 0,05 М фосфатным буферным раствором СрН 6,5), для адсорбции примесей на ионно-обменной смоле. 10 л 0 вьшедшего раствора концентрируют с помощью ультрафильтрационной аппаратуры на полых волокнах DI AFLO (фракционируемый мол. вес приблизительно 10000). Проводят диализ концентриро- увеличению и дифференциации грануло- ванного раствора на фоне 0,1 М трис- цитов, отбирают и диализуют на фоне НС1 буфера (рН 7, 0) при 5°С в тече- дистиллированной воды. Диализованный ние ночи. Диализованный раствор смеши- раствор лиофилизуют (образец 5). вают с 1 л такого же буферного раст- Около 5 мг указанного лиофштизо- вора (полз енный раствор - образец 1) 20 ванного порошка растворяют в 1 мл Указанный раствор пропускают че- 0,125 М трис-глицин буфера (рН 6,8),

,200 мг полуочищенного НСЗ-гликопр теина растворяют в 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 1,0 М хлористого натрия, и пропускают чере колонку со 100 мл конкавалина A-Sep- harose-4B, которая уравновешена таким же буфером. После тщательного промьшания колонки этим-буфером НСЗ-гликопротеин элюируют 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 50 мл ot -метил-В-глюкозида и 1,0 М хлористого натрия. Фракции которые способны к эффективному быстрому

рез колонку с целлюлозой ДЕЛЕ (4,Ох X 40 см), которая уравновегаена 0,1 М трис-НС1 буфером (рН 7,0) и промывают колонку достаточным объемом 0,1 М трис-НС буфера (рН 7,0). На наполненной колонке выполняют последовательное элюирование 0,1 М трис- НС буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,3 М хлористого натрия (о-бразец 2).

Диалиэованный раствор снова пропускают через колонку с целлюлозой ДЕЛЕ (4,0x40 см), которая уравнове- шена 0,1 М трис-НС1 буфером (рН 7,0), и на наполненной колонке выполняют элюирование с линейным концентрационным градиентом хлористым натрием (0-0,3 М). Активные фракции отбирают и добавляют с-ульфат аммония до 70% насьщ5ения. Осадки отделяют центрифугированием, растворяют в малом объеме 0,1 М трис-НС буфера (рН 7,0) и .диализуют на фоне этого же буферного раствора (диализованный раствор - образец 3).

20 мл диализованного раствора чис тят на колонке с Sephadex G-150 (4,Ох X 60 см), которая уравновешена 0,1 М трис-НС буфером (рН 7,0) и отбирают полученные выходные фракции при отношениях 1,11-1,45. Объединенные фракции тщательно диализуют на фоне дистиллированной воды при 5 С и диализованный раст вор лиофилизуют с получением 500 мг порошка (этот полуочищенньш НСЗ-гли- копротеин - образец 4).

25

30

35

40

45

50

5

содержащего 10% глицерина. Проводят электрофорез полученного раствора при мА в условиях охлаждения с помощью iпрепаративной электрофоретической аппаратуры, применяющей 8%-ньА акрил- амидный гель (рН 8,9, 20 х 25 мм). Фракцию с относительной подвижностью 6,46 извлекают 0,025 М трис-глициног вым буфером (рН 8,3) и диализуют на фоне дистиллированной воды. Диализованный раствор лиофилизуют с получением около 10 мг НСЗ-гликопротеина (образец 6).

Пример.2. К 100 мг порошка .НСЗ-гликопротеина (образец 6), полу- ; ченног о таким же путем, к-ак в пример 1, добавляют 00 мл водного раствора, содержащего 5% альбумина сыворот ки крови человека и 1% глицина. Полу- ченный раствор стерилизуют с помощью ; фильтраци онной системы, снабженной ,мембранными фильтрами с размером пор 0,45 мкм. По мл стерилизованного раствора асептически вносят в пузырь ки, которые стерилизуют нагреванием при в течение 2 ч После лио- филизации пузырьки герметично закры- ;вают. Таким образом, приготовили 95 пузырьков терапевтического агента для лейкопении, причем каждый пузырек содержал мг НСЗ-гликопротеина.V

П р и М е р 3. Таким же способом, как в примере 1, л концентрированного раствора, содержащего HGD-глико протеин, аналогичного образцу 1, го- товят из 000 л свежей мочи, собранной от нормальных людей. К этому

увеличению и дифференциации грануло- цитов, отбирают и диализуют на фоне дистиллированной воды. Диализованный раствор лиофилизуют (образец 5). Около 5 мг указанного лиофштизо- ванного порошка растворяют в 1 мл 0,125 М трис-глицин буфера (рН 6,8),

,200 мг полуочищенного НСЗ-гликопр теина растворяют в 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 1,0 М хлористого натрия, и пропускают чере колонку со 100 мл конкавалина A-Sep- harose-4B, которая уравновешена таким же буфером. После тщательного промьшания колонки этим-буфером НСЗ-гликопротеин элюируют 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 50 мл ot -метил-В-глюкозида и 1,0 М хлористого натрия. Фракции которые способны к эффективному быстрому

0 увеличению и дифференциации грануло- цитов, отбирают и диализуют на фоне дистиллированной воды. Диализованный - раствор лиофилизуют (образец 5). Около 5 мг указанного лиофштизо- 20 ванного порошка растворяют в 1 мл 0,125 М трис-глицин буфера (рН 6,8),

25

30

35

40

45

50

5

содержащего 10% глицерина. Проводят электрофорез полученного раствора при мА в условиях охлаждения с помощью iпрепаративной электрофоретической аппаратуры, применяющей 8%-ньА акрил- амидный гель (рН 8,9, 20 х 25 мм). Фракцию с относительной подвижностью 6,46 извлекают 0,025 М трис-глициног вым буфером (рН 8,3) и диализуют на фоне дистиллированной воды. Диализованный раствор лиофилизуют с получением около 10 мг НСЗ-гликопротеина (образец 6).

Пример.2. К 100 мг порошка .НСЗ-гликопротеина (образец 6), полу- ; ченног о таким же путем, к-ак в примере 1, добавляют 00 мл водного раствора, содержащего 5% альбумина сыворотки крови человека и 1% глицина. Полу- ченный раствор стерилизуют с помощью ; фильтраци онной системы, снабженной ,мембранными фильтрами с размером пор 0,45 мкм. По мл стерилизованного раствора асептически вносят в пузырьки, которые стерилизуют нагреванием при в течение 2 ч После лио- филизации пузырьки герметично закры- ;вают. Таким образом, приготовили 95 пузырьков терапевтического агента для лейкопении, причем каждый пузырек содержал мг НСЗ-гликопротеина.V

П р и М е р 3. Таким же способом, как в примере 1, л концентрированного раствора, содержащего HGD-глико протеин, аналогичного образцу 1, го- товят из 000 л свежей мочи, собранной от нормальных людей. К этому

концентрированному раствору добавля ют 10 л 0,1 М трис-НС буфера рН7,0| После тщательного перемешивания разбавленный раствор вновь концентрируют до 0,1 первоначального объема с помощью ультрафильтрационной аппаратуры на полых волокнах DIAFLO®. К концентрированному раствору добавляют 5 л 0,1 М трис-НС буфера (рН .7,0) и 5 л суспензии целлюлозы ДЕАЕ, со- 4ержащей 300 г сухой основной целлю - ДЕАЕ, которая уравновешена 4,1 М трис-HCl буфером (рН 7,0). Смесь перемешивают в течение 30 мин, йтетаивают в течейие 10 мин и Ьтфильт- 1 овьгоают под вакуумо на воронке Бюхч rtepa, отделяя целлюлозу ДЕАЕ, Отоб- Данную целлюлозу ДЕАЕ промьшают С|,1 М трис-НС буфером (рН 7,0) и 4новь отделяют фильтрацией таким же Способом, как указано выше. Далее Целлюлозу ДЕАЕ промывают 10 л 0,1 М Трис-НС1 буфером (рН 7 , Q) f содержазано выше, и отбирают отфильтрованный раствор. Отфильтрованный раст- |вор обессоливают ультрафильтрацией н полых волокнах DIAFLO, Обессоленный рдствор лиофилизуют, отбирая 15 г порошка. Порошок растворяют в 150 мл дистиллированной воды и очищают на колонке Sephadex G-150 (6,0x80 см),

Q которую уравновешивают 0,1 М трис- НС буфером (рН 7,0). Отбирают фрак ции, которые соответствуют отношению 1,. Проводят тщательный диализ объединенных фракций на фоне

,г дистиллированной воды. Диализованный раствор концентрируют с помощью концентрационной аппара туры на полых волокнах DIAFLO (тип ДС-2) до 100 мл концентрата, содержащего около 3 г

20 сырого НСЗ-гликопротеина. Концентрированный раствор смешивают с 1 г гли цина и 5 г альбумина сьгооротки. Полу ченный раствор стерилизуют фильтраци ей таким же способом, как в примере

щим 0,05 М хлористого натрия, и вновь 25 1. и- асептически заполняют порциями

по 2,5 мл пузырьки. После

отбирают таким же способом, как укапано выше. Обработанную целлюлозу ДЕАЕ добавляют к 10 л 0,1 М трис-HCl. буфера (рН 7,0), содержащего 0,3 М Хлористого натрия, и перемешивают, чтобы освободить HGD-гликопротеин От целлюлозы ДЕАЕ. Смесь отфильтро- Вьшают таким же способом, как. ука30

асептичес кой лиофилизации пузырьки герметично закрьшают. Таким образом, получено 40 пузырьков терапевтического агента для лейкопении, причем каждый пузырек содержал около 3,8 мг НСЗ-глико- протеина.

зано выше, и отбирают отфильтрованный раствор. Отфильтрованный раст- |вор обессоливают ультрафильтрацией на полых волокнах DIAFLO, Обессоленный рдствор лиофилизуют, отбирая 15 г порошка. Порошок растворяют в 150 мл дистиллированной воды и очищают на колонке Sephadex G-150 (6,0x80 см),

Q которую уравновешивают 0,1 М трис- НС буфером (рН 7,0). Отбирают фракции, которые соответствуют отношению 1,. Проводят тщательный диализ объединенных фракций на фоне

г дистиллированной воды. Диализованный раствор концентрируют с помощью концентрационной аппара туры на полых волокнах DIAFLO (тип ДС-2) до 100 мл концентрата, содержащего около 3 г

0 сырого НСЗ-гликопротеина. Концентрированный раствор смешивают с 1 г глицина и 5 г альбумина сьгооротки. Полученный раствор стерилизуют фильтрацией таким же способом, как в примере

по 2,5 мл пузырьки. После

асептической лиофилизации пузырьки герметично закрьшают. Таким образом, получено 40 пузырьков терапевтического агента для лейкопении, причем каждый пузырек содержал около 3,8 мг НСЗ-глико- протеина.