Способ получения синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

39 ловемеской ДНК посредством каталитического дейтвия активной полиме. р.азы РНК для получения РНК с последующим отжигом получающейся РНК нагревом при 70-100 С и постепенным охдаждением до комнатной температуры или ниже для образования между ее молекулами двунитчатых зон. Естественную человеческую ДНК по лучают с помощью экстракции из тканей человеческого тела обычным известным способом, в частности экстракцией с фенолом, сфенолом, насыщенным водой, или с фенолом, насыщен ным буферным раствором. , Например, ДНК выделяется из че(ловеческой плаценты в соответствии ; со способом Пэриша. Замороженную при человеческую плаценту гомо генизируют в присутствии 60 р-аминосалицилата натрия и фенол-крезольной смеси для осуществления экстракции нуклеиновой кислоты и депротеини зиции. Депротеинизация всплывающей на поверхность жидкости, полученной после центрифугирования с фенолкрезо льной смесью, проводится еще раз. Ну леиновая кислота выпадает в осадок после цинтрифугирования из всплывающей на поверхность жидкости. Осадок растворяют в слабом ионном растворе и добавляют высококонцентрированный хлористый натрий для высаливания РНК. После удаления РНК с помощью центрифугирования удаляют остаток РН и высокоагрегированную ДНК. Затем с помощью ультрацентрифуги удаляют гли коген. Полученную из всплывшей фракции ДНК осаждают и растворяют в слабом ионном растворе. Этот раствор диализируют с дистиллированндй во,дои, а диализат подвергают лиофилизации для получения в качестве лиофи лизированного продукта естественной ДНК. Полученная таким образом ДНК используется в качестве матрицы для по лимеразации рибонуклеоидных трифосфатов при каталитическом действии полимеразы РНК для синтезирования РН РНК-полимераза означает обычно зависимую от ДИК полимеразу РНК и является ферментом, катализирующим- реакцию синтеза РНЦ посредством полимеризации рибонуклеоидных трифосфатов через двойную эфирную связь q ис пользованием ДНК в качестве матрицы. Этот фермент специфичен, т.е. в ка1честве .матрицы действует лишь ДНК, экстрагированная из того же источника, что и фермент. Однако используемая в качестве фермента активная полимераза РНК обладает низкой специфичностью матрицы, так что для синтеза РНК возможно использование в качестве матрицы человеческой ДНК. Для выделения и очистки активной полимеразы РНК, например, в случае, когда она получена из Micrococcus lysodeikticus используется оригинальный способ Накамото, модифицированный частью усовершенствованного способа Вейсса. Для этогр клетки собирают на последней -логарифмической фазе их роста, хранят до использования в замороженном состоянии,а при использовайии промывают и лиофилизируют. К этому экстракту добавляют экстракт сульфата стрептомицина для- концентрации комплекса нуклеиновых кислот и нуклеопоотеинов. а после элюирования полимеразы РНК из этого комплекса посредством добавки фосфатного буферного раствора вновь добавляют сульфат стрептимицина для выпадения в осадок избирательно лишь нуклеиновой кислоты. Этот осадок удаляют центрифугированием, а мембранные компоненты и рибосомную фракцию удаляют на ультрацентрифуге. Затем добавляют сульфат протамина для образования комплекса протамин-полимераза РНК, и полимераза РНК элюируется из этого комплекса с помощБЮ фосфатного буферного раствора. Элюированная таким образом полимераза РНК реагирует с сульфатом протамина для создания , еще одного комплекса, вновь элюируется из комплекса с фосфатным буферным раствором, а элюат подвергается фракционированию с сульфатом аммиака. Фракцию, осажденную с насыщением 30-50, собирают и обрабатывают с катионитом для получения очищенной полимеразы РНК. Активность полученной таким путем полимеразы РНКв диапазоне 50-10 000 ед/мг протеина. Затем осуществляют синтез РНК с использованием полимеразы РНК и человеческой ДНК а качестве матрицы. Смесь реактантов для синтеза РНК содержит ед/мл полимеразы РНК, 100-1000 мкг/мл ДНК, 0,2-2 мМ АТР, GTP,CTP и VTP соответственно в качестве основы, мМ MnClg 0- мМ гипохлорида спермидина и 0,01-0,1 М три-НС (рН 7,0-8,0).Температура ре акции ZO-itO C, время реакции 1-10 ч Хорошие результаты получают при про должительности реакции ч. Завершается реакция охлаждением и дополнительными этапами обработки: де гидрированием полимеразы ДНК с помощью дезоксирибонуклеазы, удаления протеинов с помощью обработки в феноле, очисткой с помощью диализа. Затем диализат концентрируют посредством ультрафильтрации,а концент рат центрифугируют в CsCl в cooтвeт ВИИ со способом Глизина для выделен РНК. Полученную таким путем РНК очи щают осаждением с этанолом, а полученный прс5дукт подвергают последующей реакции температурной обработки. Эта реакция, целью которой являе ся получение двунитчатой РНК, проводится в соответствии с методом Робинсона и др. Реакцию выполняют таким образом, что РНК растворяется в двойной концентрированной SSC стандартном солевом цитрате, 0,15 М. NaCl, 0,015 М цитрата натрия) при величине рН 6,5-7,5,получившийся pa вор нагревают до 70-100°С, затем температура постепенно понижается до комнатной для окончания реакции. В данном случае желательны нагрев раствора до 70-100 С на 3 10 мин, быстрое охлаждение до комнатной температуры, затем повторный на,грев до 70-10ОС, после чего раствор вновь постепенно остывает до комнатной температуры. На этом этапе желательно долгое время поддерживать температуру между высокой и комнатной. По завершении реакции РНК восстанавливается с помощью осаждения из этилового спирта или подобным образом, полученный осадок центрифигируют и промывают,, затем растворяют в водном растворе хлористого натрия с малой концентрацией, подвергают диализу в воде при низкой температуре на протяжении 10-30 ч, при необходимости стериализуют фильтрацией, затем подвергают лиофилизации для получения препарата. Полученный таким образом индуктор интерферона в виде двунитчатой РНК, синтезированной с естественной человеческой ДНК в качестве матрицы,- белого цвета, без запаха, безвкусный, содержит по крайней не ре примерно % (нормально 10-15) двунитчатых частей в молекуле. Указанный индуктор интерферона в виде двунитчатой РНК обладает следущими физическими и химическими свойствами. Молекулярный вес. Седиментационный коэффициент определяют по градиенту плотности сахарозы при центрифугировании ( е роторе при 38000 об/мин, 3,5 ч) с использованием в качестве стандарта рибосомной РНК L-клетки мыши. В образец входит 11-13 компонентов. Растворимость. Растворим в дистиллированной воде, в буферном растворе 0,01 М три-НС ( 7,5),.двойном концентрированном растворе SSG, в растворе SSC с концентрацией О,Т (рН 7,0) и т.д. Нерастворим в этаноле и ацетоне. Спектр ультрафиолетового поглощения. 0,02 мг/мл водного раствора.образца дают спектр ультрафиолетового поглощения, типичный для нуклеиновой кислоты. Максимум поглотительной способности приходится на 2бО нм, а минимум - на 230 нм. Цветовая реакция. Реакция положи тельна при проверке орсинолом и отрицательна для дифениламина и индо- ла, соответствует характеристике цветовой реакции РНК. Реакция осаждения. К 0,5 мг/мл водного раствора образца добавляют раствор этанола двукратного объема и дают отстояться в течение более чем одного часа при -20 С. В осадок выпадает почти 100% материала. Дабавление доловины об.ъема охлажденно-й 505;$-ной тел (трихлоруксусной кислоты) к-0,1 мг/мл водного раствора образца переводит в -нерастворимую форму 80-90 РНК-ТСА, которую можно собрать с помощью фильтра (0,5 мкм). Дегидрирование рибонуклеазой. Образец растворяют в двойном концентрированном растворе SSC (рН 7,0) и подвергают обработке вместе с бычьей рибонуклеазой поджелудочной железы (10 мкг/мл) и рибонуклеазой -Т(1 мкг/мл) в течение 30 мин при . В результате примерно 11-13 образца остаются непоглощенными. С другой стороны, образец растворяют в растворе SSC (рН 7,0) с концеитрэ цией 0,3, нагревают , затем быстро охлаждают и обрабатывают вместе с упомянутой выше рибонуклеазой после перенесенияраствора в раствор SSC двойной концентрации. В результате непоглощенными остаются 2-3. Поглощение дезоксирибонуклеазой. Образец растворяют в 0,01 М буферно го раствора три-НС (рН 7,) и обра батывают с дезоксирибонуклеазой (50 мкг/мя) при в течение 30 мин. Полученная в результате пр порция нерастворимой фракции ТСА та же, что и при указанной выше обрабо ке, причем увеличение поглотительной способности при 2бО им не заметно, ни до ни после обработки. Чувствительность к щелочному гид ролизу. Образец растворяют в 0,3 М гидроокиси калия и выдерживают при 37 в течение 18 ч. Образец гидролизуется полностью. Анализ продукта гидролиза с помощью тонкослойной хооматографии показывает лишь отдельные пятна адениловой кислоты, амидиновой кислоты, цитидиноаой кислоты Иуридиноврй кислоты. Состав, Анализ состава выполняют с помощью тонкослойной хроматографии на продукте щелочного гидйолиза . В результате анализа установлено, что молярное отношение каж дого нуклеотида находится в диапазо не 27,,О-30,5 адениловой кислоты, 20,6-24,7% амидиновой кислоты, Т6,8 2,3 цитидиновой кислоты, и 27,832,7 уридиновой кислоты. ,.Плотность на всплывание образца в « .Плотность на всплывание образца в . измеряют с помощью ультрацентрифуги (Spinco SW 50,1 ротор, 31500 об/мин 72 ч). Она равна 16351640. . Термическая денатурация рибонукл азы - стойкость РНК. Образец раство ряют в растворе SSC (рН 7,0) концентрации 0,1, температуру плавлен /( определяют в соответствии со способом К. Колби и Д, Г, Дьюсберга, Она оказал ась равной 71С, Спектральная поглотительная способность увеличивается с повышением температуры. Образец растворяют в р створе SSC (рН 7,0) с концентрацией 0,1, затем определяют увеличение поглощения при 2бО нм при повышении температуры. Наблюдаются возрастание примерно на 20% в диапазоне | температур 25-90 С. Чистота. Оценку чистоты образца выполняют следующим образом. Количество протеина определяют по методу Фолина-Лоуни, а количество ДНК - по SST-методу, модифицироiванному Мицуно и др. Загрязнений протеина и ДНК не наблюдается. Наблюдения под электронным микроскопом. Наблюдения под электронным микроскопом показывают, что большинство молекул РНК являются линейными, длина их 0,1-3 мкм. Двунитчатая РНК, обладающая описанными выше физическими и химическими свойствами, может быть использована в качестве интерферона по той причине, что она индуцирует интерферон и обладает чрезвычайно малой токсичностью. При изготовлении различных медицинских препаратов-стабилизаторов, среди которых могут быть человеческий альбумин,, маннитол и. др. , агенты повышенной растворимости , глицин и такие вещества, как сорбитол - могут быть добавлены к раствору до проведения лиофилизации, причем раствор уже.содержит активный материал. При использовании изготовленный таким образом медицинский препарат растворяют (в физиологическом растворе, стериализованной воде, стерилизованном изотоническом растворе для инъекций t т.д.) и назначают пациентам в качестве индуктора интерферона посредством внутривенных, мышечных или подкожных инъекций. Эффективная доза от 1 до 2 мг на килограмм веса тела в день, при необходимости доза может быть увеличена, Препарат эффективен в качестве лекарства даже в неочищенном виде, т.е. в смешанном состоянии с однонитчатой РНК, достаточно эффективны k% или более двунитчатой РНК. Биологические свойства препарата подробно описаны в примерах 1-7. Пример 1.Противовирусную активность определяют измерением вирусной производительности в соответс1вии с частично модифицированным методом. Т.е. 0,0; 1,0; 10 и 50 мкг/мл образцов индуктора интерферона (препарат по настоящему изобретению и Poly 1:С в качестве контроля), 50-мкг/мл декстрана ДЕАЕ (молекулярная масса 50x10) и 3 мл минимальной среды фирмы Игл (далее упоминаемой как МЕМИгл) , дополненных 0,5% утробной телячьей сыворотки, добавляют к однослойным клеткам (2,5-3x10 клеток/колбу) в 50-мл колбы для выращивания культур, затем выдерживают при 37°С в течение 20 ч. После ин инкубационного периода среду Игл MEM содержащую возбудитель интерферона, удаляют и клетки трижды промывают соляным раствором Хенкса, затем добавляют вирусы Vesicular stomatitis (V.S.V.) с кратностью инфекции от 2 до 3 бляшкообразующих единиц на клетку. Вирусы адсорбируют при в течение 1 ч. После адсорбции для удаления свободных вирусов V.S.V. клетки промывают пять раз и добавляют 5 мл новой содержащей среды (среда MEM Игл, содержащая 1 утробной телячьей сыворотки). После инкубационного периода, продолжающегося 20 ч при 3/ С, клетки охлаждают в холодильнике при . Охлаждение и оттаивание повторяют дважды, затем клетки направляют на центрифугу (2000 об/мин, на 10 мин). Титр вирусов во всплывшем веществе определяют с помощью анализа культур клеток FL. Вирусы с клеток, обработанных средой MEM Игл без возбудителя интер ферона (с содержанием сыворотки или ДЕАЕ - декстрана), используют как контрольные. Использованные клетки относятся к двум разновидностям установленных . клеточных линий человеческих амниотических клеток FL и клеток почки кролика RK-13i а также человеческих зародышевых диплоидных клеток крайней плоти (HFS) и человеческих зародыше ,вых почечных клеток НК. Гетероплоидные клетки клеток НК первоначально рассаживались примерно 130 раз. Эти клетки выращивают в среде MEM Игл,дополненной 10 утробной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл пенициллина G, 100 мкг/мл сульфата стрепто|мицина и 60 мкг/мл канамицина. По за вершении инкубации виоусов клетки культивируют в среде, в которой количество сыворотки уменьшено до 1. Клетки культивируют в инкубаторе с содержанием С0„( СО) . Используемое в качестве контрольного вещества Poly 1:С, расмотренное в фосфатном буферном растворе .pH /,0} с концентрацией 2,5 мг/мл, хранилось при -30 С, а при использовании разжижалось. Результаты приведены в табл. 1, откуда видно, что хотя между клеткрми-есть небольшое различие, противовирусная активность препарата та же, что и у Poly 1:С. Таблица 1 - бляшкообразующая единица, П р и м е р 2 . Активность индуцирования интерферона проверяют добавкой предлагаемого препарата к культивированным клеткам. Этот тест проводится с использованием метода Вилцека, при этом 2 мл среды MEM Игл (без -сыворотки), содержащей 5- 50 мкг/мл возбудителя интерферона и 100 мкг/мл циклогемиксида, добавляют к клеткам HFS, образовавшим онослой в пластиковой чашке Петри .диаметрсм 6 мм. Клетки выдерживают в термостате в течение 5 ч при 37 С. К среде добавляют 0,5 мл актиномици-, на.с тем, чтобы окончательная концентрация стала равной 1 мкг/мл. За тем продолжают в течение 1 ч при 37 инкубацию. После полного завершения инкубации клетки промывают соляным раствором Хенкса пять раз, затем добавляют 5 мг MEM Игл с 0,5% сыворотки. После 20 ч инкубации при 37С сбреду собирают и центрифигиру ют (1000 об/мин) в течение 5 мин дл получения псплывшего вещества, содержащего интерферон. Тест на интер ферон проводят с использованием кле ток PL. Тест на интерферон проводят по модифицированному методу Вилцека. М,онослойные клеточные культуры в пл тиковой чашке Петри промывают и при вивают двум разведенным в два раза образцам интерферона в среде MEM Игл, содержащей утробную телячью сы воротку, затем помещают в термостат на 20 ц при . После промывки клеточных слоев их подвергают действию примерно 100 на чашу виру сов y.S.V., а полученные пластинки подсмитыЁают после двух- или трехднейной инкубации. Титр интерферона выражают как величину, обратную чис лу разбавления образца, уменьшавшего число бляшек на 501 от контрол ного, на которое была нанесена сред НЕМ Игл вместо образца. Титр образц интерферона человеческих клеток опр деляют одновременным определен ем стандартного человеческого лейкоцитарного интерферона для преобразова ния в международные единицы (1 U). качестве контрольного используют Poly 1:С. Предлагаемый препарат проявляет большую активность индуцирования ин терферона по сравнению с Poly 1:С, П р и м е р 3. Действие интерфер на в живом организме.. Кроликам-самцам весом 2„0-2,5 кг .проводят внутривенную инъекцию 10100 мкг/кг препарата или Poly 1:С в качестве контрольного средства. Непосредственно до инъекции, а также после, 1, 2, k, 8, 11 и 2 ч после инъекции у кроликов берут кровь. Активность индуцирования интерферона определяют анализом содержания интерферона в полученной сыворотка. Метод Т|1трования интерферона аналогичен упомянутому методу Вилцека и др. за тем исключением что вместо «клеток FL используют клетки RK-13 Предлагаемый препарат проявляет активность индуцирования интерферона в живом.организме, равную или превышающую активность Poly 1:С. Пример. Тест на токсичность. Изучается эффект предлагаемого препарата и РоГу1:С в качестве контрольного средства на культивированных клетках.При этом в колбу 5 мл одновременно помещают j мл суспензии человеческих амниотических клеток FL (60 X Ю клеток на мл), а также 1 мл среды MEM Игл, содержащей 5,50 и 250 мкг/мл (растворенных окончательно в 5 раз) препарата. Клетки культивируют при в течение 6 дней.. После 2, и 6 дней культивации отбирают по две колбы из каждой группы, для удаления плавающих клеток их промывают фосфатным буферным раствором. Оставшиеся клетки отделяют от стеклянной поверхности с помощью 0,02 этилендиамин-тетрацетата (ЕДТА) и трипсина (0,25%) для подсчета их числа. Затем число жизнеспособных клеток подсчитывают с помощью окращивающего вещества эритроцина б и гемоцитомера. Контрольный препарат Poly 1:С до некоторой степени токсичен даже при концентрации 1 мкг/мл, при 10 мкг/мл токсичность существенно заметна, а при 50 мкг/мл размножение клеток не наблюдалось. В противоположность контрольному получаемый препарат не обнаруживает токсичности при концентрации 10 мкг/мл или меньше, размножение клеток подавляется лишь очень незначительно даже при концентрации 50 мкг/мл. . Из приведенных экспериментов видно, что полученный препарат является средством возбуждения интерферона, обладает противовирусной активностью, примерно равной или превышающей активность Poly 1:С, и в сравнении с ним является менее токсичным. П р и м е р 5. Острую токсичность полученного препарата проверяют, используя самцов мыши (UjBL, в соответствии с методом .Лидича и Вилкоксона. Результат показал, что от внутрибрюшного введения препарата на уровне 50 мг/кг веса тела или при внутривенном вливании на уровне 25 мг/кг гибели мышей не было. Для мышей доза подкожном введении препарата - не менее 50 мг/кг, при внутривенном введении не меньше 25 мг/кг. Получение синтетической двунитча той РНК поясняется следующими примерами. П р и м е р 6. Выделение и очищение ДНК человеческой плаценты. Плаценту, замороженную непосредственно после родов и хранившуюся при , измельчают на куски до 60 г, к ней добавляют 15 объемов 6%-ного раствора аминосалицилата и 15 объемов смеси фенола с крезолом (состав: фенол 500 г, м-крезол 70 мл вода 55 мл и 8-гидроксилхинолин 0,5 Полученную смесь гомогенизируют при комнатной температуре в течение од - ной минуты в смесителе при максимал ных оборотах. Полученную таким образом суспензию размешивают при комнатной температуре в течение 20 мин затем центрифугируют в течение 30 ми при и 6000 X g для удаления дена турированного протеина и фенола. К всплывшей жидкости добавляют хлористый натрий с тем, чтобы его конечная концентрация стала равна 3 а также половину объема всплывшей смеси фенол-крезола. Смесь размешивают при комнатной температуре в течение 20 мин, затем центрифугиру ют в течение 10 мин при 5 С и 8000 X g. К - всплывшей жидкости добавляют два объема охлажденной этиловой спиртово-крезольной смеси (объемное отношение 9:1) и осторожно смешивают для образования,осадка. После того, как волокнистый осадок намотают на стеклянный стержень, оставшуюся жидкость отстаивают 1 ч при , затем оставшийся осадок восстанавливают центрифугированием ,Общий осадок тщательно промывают в достаточном объеме 75 -ного этилового спирта с содержанием 2% ацетата .натрия и полностью растворяют в .200 мл 0.1 М ацетата натрия, содержащего 5 мМ фторида натрия. К этому раствору добавляется хлористый натрий с конечной концентрацией 3 М. Этот раствор отстаивают в течение 15 ч при (-2) -(-5)с и центрифугируют 1C мин при и 12000 X g. К всплывшей жидкости добавляют водный объем охлажденной этилцеллюЛОЗЫ и осторожно смешивают до получения белого волокнистого осадка. После отстаивания в водяной бане при О с в течение 20 мин волокнистый осадок извлекают с помощью стеклянного стержня, диспергируют и растворяют при комнатной температуре в 300 мл 3 М буферного раствора ацетата натрия (рН 6,0), содержащего 5 мМ фторида натрия. Когда растворение почти полностью завершится, раствор центрифугируют при 5 С в течение 10 мин при 2000 X g для удаления остаточной PWK и сильно агрегированной ДНК в качестве осадка. К всплывшему веществу добавляют равный объем охлажденной этилцеллюлозы, и смесь отстаивают в течение 20 мин в водяной бане при . Полученный волокнистый осадок наматывают на стеклянный стержень, диспергируют и растворяют при комнатной температуре в 200 мл 0,1 М буферного раствора ацетата натрия (рН 6,0), содержащего 5 мМ фторида натрия. Koi- pa растворение завершится почти полностью, раствор центрифугируют в течение 90 мин при и 60000 X ig для удаления гликогена как осадка. К всплывшему веществу добавляют ацетат натрия с конечной концентрацией О , 3 М и смешивают с равным объемом охлажденной этилцеллюлозы. После отстаивания в течение 20 мин в водяной бане при волокнистый осадок собирают, с помощью стеклянной палочки и растворяют в 16 мл 0,1 М буферного раствора ацетата натрия (рН 6,0), содержащего 5 мМ фторида натрия. По завершении растворения раствор передают в диализный трубопровод и диализуют в течение tS ч при с 200 мл дистиллированной воды, пятикратно., сменяя внешний раствор. Диализат центрифугируют для удаления нерастворимых материалов и определяют концентрацию ДНК посредством из мерения коэффициента поглотительной способности при 2бО им разведенного всплывшего на поверхность вещества. Расчет концентрации ведут с учетом того, что коэффициент спектральной поглотительной способности при 260 нм 1 мг/мл ДНК равен 20. Растворы с содержанием 6,5 мг ДН помещают в пробирки 10 мл и подвергают лиофилизации. После проведения указанных процедур получают в сумме iiO кг че юаемеской ДНК, Для оценки мистоть} препарата ДНК определяют количество протеина по усовершенствованному методу Лоури, Количество РНК определяют по методу Мицуно. Протеина было Q,k% в виде альбумина человеческой плаценты. РНК было Ц,8% от общего числа нуклеотидов. Очищение полимеразы РНК. На питательном бульоне выращивают Microcx)eCUS lysodeiktiois с использованием Jar Fermenter. По достижении последней логарифмической стадии роста их собирают и хранят -при . kOQ г замороженных клеток диспергируют в 2 л 0,0t М буферного раствора три-НС1 и центрифугируют, чтобы co6f рать промытые клетки, которые затем диспергируют в 0,01 М буферном растворе три-НС1 (рН 8,0), содержащем -0,2 М сахарозы, для получения конечного объема 2 л. К этой суспензии добавляют 600 мг белого лизоцима куриных яиц, и суспензию выдерживают в термостате при . После 15 мин инкубации добавляют 6 мл 0,1 М MgClg и выдерживают в термостате еще 5 мин для разрушения стен клеток. Затем добавляют 18 мл 0,1 М MgCla. и мл воды, охлажденной до . Смесь энергично перемешивают. Все процедуры проводят в водяной бане при 0°С. Через 10 мин добавляют 600 мл 10%-ного сульфата стрептомици на, а еще через 10 мин полученный осадок центрифугируют в течение 10 мин при и 20000 X g. ПЬлученный осадок суспендируют в ВОО мл 0,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 8,0), содержащего 0,2 М сахарозы, 0,1% сульфата стрептомицина и 0,00035 М MgCl . Через 10 мин раствор центрифугируют при в течение 10 мин при 20000 X gjc Осадок гомогенизируют в 720 мл {Раствора, приготовленного смешиванием В мл 1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,5)jB мл 0,1 М MgCl2.и ВО мл 2 М сахарозы, разбавлением смеси дистиллированной водой до 720 мл с ис пользованием тефлонового гомогенизатора фирмы Поттер-Элвейхем. К этому гомогенату добавляют 32. мл, М буферного раствора фосфата калия (рН 7,5) а еще через десять минут -.70 мл 10 -ного сульфатастрептомицинИ.Посл 10 мин перемешивания полученный дсадок отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 5 С и 30000 х g. а полученное в результате всплывшее вещество подвергают дальнейшему центрифугированию при в течение 2 ч при 105000 X g для удаления компонентов мембраны и рибосомной фракции. К ВОО мл полученного при ультрацентрифугоровании всплывшего вещества добавляют 110 мл 1 М буферного раствора фосфата калия (рН7,5),а затем 160 мл 2,5%-ного ненейтрализованного сульфата протамина для выделения полимеразы РНК в осадок как комплексно го соединения с сульфатом протамина. После 10 мин перемешивания осадок собирают с помощью центрифугирования в течение 10 мин при 5 С и 20000 х g. Осадок гомогенизируют в IBO мл 0,2 И буферного раствора фосфата натрия (рН 7,5), содержащего 0,2 М сахарозы для элюирования полимеразы РНК. После t0-минутного перемешивания суспензию центрифугируют в течение. 10 мин при и 30000 х fi. К всплывшему веществу добавляют ЗЬО мл 0,1%-ного сульфатного раствора ненейтрализованного протамина, и вновь полимераза РНК выпадает в осадок как комплексное соединение с сульфатом протамина. После 10 мин перемешивания суспензию центрифугируют в течение 15 мин при и 20000 X g. Осадок гомогенизируют в 50 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,2 М сахарозы, и гомогенат подвергают центрифугированию в течение 10 мин при 5 С и 30000 X g. Собранный осадок гомогенизируют в 30 мл 0,2 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,2 М сахарозы для элюирования полимеразы РНК. После 10 мин :перемешивания суспензию центрифугирует в течение 15 мин при и 30000 xg.K всплывшему веществу (30 мл ) добавляют 7,27 г сультата аммиа1 а с тем, чтобы получить 0%-нoe насыщение для осуществления фракционирования сульфата аммиака. Спустя 15 мин после добавления сульфата аммиака суспензию центрифугируют в течение 10 мин при 5°С и 30000 х g.Осадок растворяют в 5 мл 0,02 М буферном.растворе три-НС1 (рН 7,5)f содержащем 0,3 М сульфата.аммиака , и добавляют равный объем глицёролп. Раствор разбавляют в 2,5 раза. 0,01 М буферным раствором триНС1 (рН 7,5) и пропускают сквозь СМ-целлюлозную колонку в стеклянном 17 фияьтре, приготовленном с испольэов нием 2,k г СМ-целлюлозы для удаления рибонуклеазы. Колонку промывают 0,01 М буферным раствором тр,и-НС1 (рН 7,5), содержащим 20% глицероля и 0,06 М сульфата аммиака, и элюат пропускают сквозь колонку СМ-целлюл зы, приготовленной с использованием 0,8 г СМ-целлюлозы. Г1осле промывания колонки к суммарным 80 мл элюата добавляют 22,2 сульфата аммиака для осуществления осаждения сульфата аммиака. Через 15 мин полученный осадок собирают центрифугированием в течение 15 ми при и 30000 X g, а полученное таким образом осажденное вещество растворяют в J мл 0,02 М буферного раствора три-НС1 (Н 7,5), содержещего 0,3 М сульфата аммиака, а потом добавляют равный объем глицероля и до использования хранят при . Из «ОО г замороженных клеток оолучают 3 мг препарата полимеразы РНК с удельной активностью 190 ед-. на мг протеина (суммарная активност 8200 ед) и отношением спектральной поглотительной способности при 280 : 260 нм 1,55. Одна единица ферментной активнос ти определяется как количество, кат лизирующее при введении 1 н моль 1А С - АТР нерастворимый ТСА матери ал в течение 10 мин инкубации. Каждый реактив растворяют в 0,1 буферного раствора три-НС1 (рН 7,5) В табл. 2 приведены используемые при синтезе РНК реагенты, общее кол чество 500 мл. Таблица 10000 100 м 200 18 ,Пдр }олжение табл. 2 Ненейтрализованный тригидрохлорид спермидина 2 Три-НС, рН 7,5 Указанные выше реагенты тщательно смешивают и 1аыдерживают в термостате в течение 3 м при в водя-ной бане. Затем эту смесь охлаждают в водяной бане при до окончания реакции и нагревают в течение 5 мин при 65С для инактивации полимеразы РНК. Реакционную смесь охлажл дают примерно до проточной во-, дои, затем к ней добавляют 5б мл О , 1 М MgCl 2. для доведения раствора до 10 мМ, Затем добавляют 5,6 мг дезоксирибонуклеазы (без рибонуклеазы) и помещают в термостат на 30 мин при 37С для дегидрирования ДНК. 8 течение 3 мин реакционную смесь нагревают при для инактивации дезоксирибонуклеазы, затем охлаждают проточной водой до комнатной температуры.. После этого к ней добавляют 5бО мл двойной концентрированной SSC (рН 7,0} и 1120 мл фенол-крезольной смеси (состав: фенола 500 г, t- м-крезола 70 мл, воды 55 мл, 8-гидроксихинолина 0,5 г). В течение 5 мин реакционную смесь встряхивают, затем центрифугируют в течение 10 мин при и 5000 X g. Отделенное от фенольного слоя и слоя денатурированного протеина всплывшее вещество получает добавку половины объема упомянутой выше фенол-крезольной смеси, затем его встряхивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Полученное посредством центрифугирования всплывшее вещество вновь диализируют с 5 М раствора SSC с двойной концентрации (рН 7,0). содержащего 0,05% додецилсульфата натрия (упоминаемого далее как SDS),1ч при комнатной температу|эе и еще 1 ч после замены внешнего раствора. После этого внешний раствор заменяют 5 л 0,01 концентрации SSC (М 7,0) ) ализ продолжают всю ночь при 2-5 С.

Диализат (890 мл) подвергают ультрафильтрованию G использованием пустотелого волоконного мембранного фильт ра до сгущения до 19.мл.

В 19 нл ультрафильтрованного концентрата растворяют 19 г . Затем общий объем доводят до 26 мл до-ч бавкой 0,01 М буферного раствора триНС1 (рН 7,5), содержащего DjС1 в пропорции 1 г на 1 мл буферного раствора. Этот раствор (2б мл) наносят на 7,8 мл 5,7 И CgCl (рН 6,5), содержащих 0,1 М ЕДТА, затем наносят 1,3 м 0,1 М буферного раствора три-НС1 (рЛ 7,5) и все это центрифугируют. Центрифугирование проводят на роторе при 27000 об/мин (130000 х g) в течение 15 м при 15°С.

После центрифугирования всплывшее вещество удаляют и РНК в виде светлых гранул растворяют в 30 мл 0,1 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,5). Полученный раствор охлаждают в ной бане при .и добавляют к нему два объема охлажденного этилового .спирта, все это отстаивают 1 ч при -20 С. Затем полученный осадок соби рают с помощью иизкоскоростного центрифугирования. Всплывшее вещество . удаляют и осадок вновь растворйют в 0,01 М буферном растворе три-НС1 (рН 7,5)..

Выход очищенной РНК 8,6 мг в соответствии с расчетом из соотношения А2бО 22, где А2бО - спектральная поглотительная способность при . 260 нм 1 мг/мл раствора РНК.

При добавлении 50 ТСА в осадок выпадает примерно 80% очищенной РНК как нерастворимой фракции ТСА. Седиментационный коэффициент очищенной РНК, который измеряют с помощью градиентного центрифугирования сахарозной плотности с использованием в качестве стандарта -мьшиной Ь-клеточной рибосомной РНК, равен примерно 12 с.

Отжиг РНК. 3 мг очищенной РНК растворяют в 4,8 мл 0,01 М буферного раствора три-Не1 (рН 7,5) и добавляют к раствору 1,2 мл SSC 10-кратной концентрации (рН 7,0) с тем, чтобы концентрация РНК в двухкратной концентрации SSC стала равной 500 мкг/мл. Полученный та- КИМ образом раствор помещают в стеклянную пробирку с заглушкой, нагревают 5 мин при 10(РС, быстро ожлаждают в водяной бане при , затем помещают в водяную баню при 85°С. Температуру водяной бани постепенно понижают в течение 2 ч до , и рекция происходит k ч при . Затем отключают нагреватель водяной бани, и раствор отстаивается ночь с постепенным охлаждением до комнатной температуры.

Седиментационный коэффициент отожженной РНК определяют методом градиентного центрифугирования сахарозной плотности. Наблюдается пик при 12 с, причем полученный результат практически не отличается от того, что был получен до отжига, однако наблюдается небольшой новый пик в области примерно 28 с.

Устойчивость рибонуклеазы отожженной РНК (число РНК -гибрида РНК; количество двунитчатых частей) определяют по методу Гемперта. 30 мкг отожженной РНК обрабатывают вместе с 20 мкг рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы и 2 мкг рибонуклеазыjT в растворе SSC двойной концентрации (рН 7,0) в течение 30 мин при , в результате с помощью фильтрата (0,5 мкм) получают 13,3 нерастворимой фракции ТСА без следов дегидрирования,

С другой стороны, 30 мкг образца, нагретые при в SSC с концентрацией 0,3 и быстро охлажденные в водяной бане при О С, подвергают рибонуклеазной обработке в SSC двукратной концентрации, как упомянуто выше в результате получают недегидрированных 2,3 нерастворимой фракции ТСА.

Отожженная РНК регенерирована с помощью осадка этанола по типовому методу. Осадок диализируют с дистиллированной водой, диализат стериализуют фильтрацией с разделением на пробирки и подвергают лиофияизации.. Полученные таким образом препараты являются йндyktopaми интерферона и обладают его физическими, химическими и биологическими свойствами, j П р и М е р 7. Выделение и очищение ДНК человеческой плаценты.

Процесс осуществляют по тому .же методу, что и в примере 6.

Очищение полимеразы РНК Ercoli. Штамм Е. coll выращивают в питательном бульоне с использованием Jar Fermenter, собирают на последней стадиии логирифмической фазы роста и хранят при . 250 г этих клеток суспендируют в 750 мл буферного раствора Грайндинга (0,05 М буферного раствора три-НС, рН 7,9) содержащего 5 глицероля, 2 мМ ЕДТА 0,1 мМ дитиотреитола, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,233MNaCl, 130мкг/м белого лизоцима куриных яиц и 23 мкг/мл фторида фенилметансульфонила) и отстаивают в .течение 20 мин при . Затем добавляют 0,0125 объма 4 ДОС (дезоксихолат натрия) и смесь перемешивают 39 с. После отстаивания в течение 20 мин вновь перемешивают 30 с. Затем 1000 мл ТСЕД + 0,2 М NaCl (ТСЕД 0,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,9) , содержащего 5 глицерола, 0,1 мМ ЕДТА и 0,1 мМ дитиотреитола, ТСЕД + 0,2 М NaCl - ТСЕД с содержанием 0,2 М NaCl ) были добавле ны к раствору и энергично перемешивались в течение 5 мин. Суспензию центрифугируют kS мин при k С и 100.00 X g. К полученному всплывг шему веществу добавляют 0,075 объема Polymin Р (рН 7,9).Спустя 5 мин полученный осадок собирают центрифугированием в течение 15 мин при С и 6000 X g. Осадок гомогенизируют в ТСЕД + 0,5 М NaCl (ТСЕД с содержанием 0,5 М NaGl), гомогенат перемешивают 10 мин при , а затем центрифугируют 30 мин при 4°С и 6000 X g. Полученный осадок гомогени зируют в ТСЕД + 1,0 М МаСГ (ТСЕД с содержанием 1,0 М NaCl) и перемешива ют при в течение 10 мин. Гомогенат центрифугируют 30 мин при Ц°С и бООО X g.K полученному в результате всплывшему веществу добавляют сульфат аммиака в пропорции 35 г на 100 мл, все это перемешивают 30 мин при k С. Затем суспензию центрифугиг руют kS мин при и 10000 X g. По лученный осадок растворяют в 700 мл ТСЕД. Этот раствор пропускают сквозь ко лонку с агарозой и ДНК телячьей зобной железы (2,6 х 15 см), изготовленную в соответствии с методом Шал лара, для поглощения полимеразы, РНК. Колонку промывают 500 мл ТСЕД+ + 0,15 М NaCl (ТСЕД с содержанием 0,15 М ), затем 500 мл ТСЕД-+ j+0,3 М NaCl (ТСЕД с содержанием 0,3 NaCl).После этого сквозь колонку пропускают 500 мл ТСЕД + Колонку пропускают 500 мл ТСЕД+ + 1,2 М NaCl для элюирования полиме разы РНК. К элюату добавляют суль- I фат аммиака с пропорции 35 г на 100 мл и перемешивают 30 мин при tfC. Образовавшуюся супензию подвергают центрифугированию,в течение 30 мин при С и 10000 X g. В результате получен осадок- раствор 7 мл ТСЕД + 0,5 М NaCl + 30% глицероля (ТСЕД + 0,5 М NaCl за тем отличием, что содержится 301 глицероля вместо 5°4). Раствор делится на 2-3 равные части, и каждую часть подвергают фильтрованию сквозь гель через колонку с Био Гель А 5 М (Полиакриламидгель), уравновешенную ТСЕД -t- 0,5 М I-IaCl. Элюирование производят с ТСЕД + +0,5 NaCl, Из элюата извлекают фракции, обладающие активностью полимеразы, РНК, и используют для синтеза РНК. Удельная активность полученной та- КИМ образом полимеразы РНК равна 320 ед/мг протеина при определении по методу Бургесса с использованием в качестве матрицы ДНК зобной железы теленка. Единицу активности фермента определяют как количество, катализирующее введение 1 н объема k С-АТР в материал нерастворимой в течение 10 мин инкубации. Коэффициент спектральной поглотительной способности между 280 и 2бО нм оказался равным 1,86. Суммарная активность полимеразы РНК, полученной из 250 г замороженных клеток, оказалась равной 30000 ед, а суммарное количество протеина - 96 мг. Синтез, выделение и очистка РНК. Реагенты, предназначенные для синте- за РНК, приведены в табл. 3; (всего 150 мл). Каждый реагент растворялся в 0,04 Н буферного раствора триНС1 (рН 7,9). т 1 - Т а б л и ц а 3. Полимераза 20 ед/мл 3000 ед НК челове еской пла 200 мкг/мл 23, Продолжение табл. 3 0.5 тоэтанол Т|зи-НС1, М рН 7,9 Указанные реагенты тщательно сме шивают и помещают на 3 м в термостат при 37С. Затем реакционную смесь охлаждают в водяной бане при для окончания реакции, нагреваю в течение 5 мин при для инакти вации полимеразы РНК и охлаждают пр точной водой при(ерно до 37°С, зате добавляют 16,7 мл 0,1 М MgClj. , что бы довести раствор до 10 . После этого добавляют 1,7 мг дезоксирибон леазы (без примеси рибонуклеазы) помещают в термостат на 30 мин при 37 С для дегидрирования, ДНК. Реакционную смесь нагревают до (100 С в течение 3 мин для инактивац дезоксирибонуклеазы, затем охлаждают пробочной водой до комнатной темпера туры. После этого добавляют 170 мл S -двойной койцентрации (рН 7,0} и мл фенол-крезольной смеси (состав : фенола 500 г, м-крезола 70 мл воды 55 мл, гидроксихинолина 0,5 г) В течение 5 мин реакционную смесь встряхивают при комнатной температуре, затем центрифугируют 10 мин при и 5000 X g. К отделенному от фенольного слоя и сл|эя денатури рованного протеина всплывшему ве- ществу добавляют половину объема фенол-крезольной смеси и встряхивают при комнатной температуре в течение 5 мин. / Эмульсию центрифугируют и всплыв шее вещество диалйзируют с 5 л . SSC двойной концентрации (рН 7,5), содержащей 0,05% Sre, в течение 1 ч при комнатной температуре, и диализи руют вновь в течение 1 ч после замены внешнего раствора. Затем, внешний раствор заменяют 5 л концентрации 0,01 (рН 7,0) и диализ 01 ведут еще в течение ночи при . Диализат {310 мл) подвергают ультрафильтрации с использованием волоконного мембранного фильтра до получения 19 мл концентрата, В 19 мл концентрата, полученного ультрафильтрации, -растворяют I19 г . Затем общий объем доводят до 26 мл добавкой 0.01 М 6v(beDного раствора три-НС1 (рН 7,5), содержащего CgCl в пропорции 1 г на 1 мл буферного раствора. Раствор (26 мл) наносят на 7,8 мл 5,7 М С$С1 (рН 6,5), содержащих 0,1 М ЕДТА, а затем туда наносят еще 1,3 мл 0,1 М буферного раствора триНС1 (рН 7,5) и центрифугируют. Центрифугирование ведут в роторе в течение 15 ч при и .2700р об/мин (,130000 X g). После центрифугирования удаляют всплывшее вещество и РНК в чистой грануле растворяют в 3 мл 0,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,5). , , .,. Полученный раствор охлаждают ft -- «-- -- дяной бане при ОС, добавляют два объема охлажденного этилового спирта и дают отстояться при в течение 1 ч. Полученный осадок собирают с помощью низкоскоростнрго центри «фугирования. Всплывшее вещество удаляют, и осадок вновь растворяют в 0,01 М буферном растворе три-НС1 (рН 7,5). Выход очищенной РНК равен 9,0 мг. При добавлении 501 ТСА в осадок выпало примерно 90% очищенной РНК как нерастворимой фракции ТСА. Седиме«тационный коэффициент очищенной . . замеренный с помощью центрифугирования для определения градиента плотности сахарозы с кспольаованием рибосомной РНК L-клеток мыши в качестве стандаота равен поимеоно 11 с. Отжиг РНК. 3 мг очищенной РНК рястворяют в 12,0 мл 0,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,5), добавляют 3,0 мл SSC с 10-к0атной концентрацией fpH 7,0) т тем, чтобы концентрация РНК в двукратной концентрации SSC стала равной 200 мкг/мл. Полученный раствор помещают в стеклянную пробирку с пробкой, прогревают 5 мин при . быстро охлаждают в водяной бане, при , после чего помещают в водяную баню при 85С. Темперауру водяной бани постепенно понижают до втечение 2 ч, и при реакция протекает еще А ч. За-::тем отключают нагреватель водяной бани, и в течение ночи раствор отстаивается, постепенно охлаждаясь . до комнатной температуры. Устойчивость рибонуклеазы отожжен ной РНК (количества гибридной РНК-РН число двунитчатой части) определяют по методу Гемперта и др. 30 мкг отожженной РНК обрабатывают вместе с 20 мкг рибонуклеазы бычьей поджелудо ной железы и 2 мкг рибонуклеазы- 1 в 3SС двукратной концентрации (рН 7,0) при в течение 30 мин, полученная в результате 12,0% нерастворимая фракция ТСА бео дегидрирования была собрана миллиНоровым фильтром (0, мкм) . С другой стороны, 30 мкг образца,нагретых в 33С 0,3 концентрации в течение 5 мин при и быстро охлажденных в водяной бане, при , подвергнуты рибонукле азной обработке, как упомянутого выше, в результате собрано 3,3% нерастворимой фракций недегидрированной ТСА с помощью фильтра, Отожженная РНК регенерирована с помощью осажде 1ия этанола в соответствии с типовой процедурой. Осадок диализируют с дистиллированной во дои, диализат стериализуют фильтрацией, разделяют по ампулам и подвергают лиофилизации, В состав очищенной РНК входят, % :адениловая кислота 27,3, амидиновая кислота 21,5, цитидиновая кислота 18,5, уридинрвая кислота 32,7. Предлагаемый способ позволяет повысить интерферониндуцирующую активность целевого продукта. Формула изобретения Способ получения синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью,путем использования человеческой ДНК в качестве матрицы для ферментативного синтеза, отлимайщийс я тем, что, с целью повышения интерферониндуцирующей активности целевого продукта, аденозинтрифосфорную, уридинтрифосфорную, гуанидинт трифосфорную и цитидинтрифосфорную кислоты инкубируют с ДНК из человеческой плаценты в присутствии активной РНК- полимеразы Mictococcus lysodeiktiais или Eseherichia coli в течение 2- ч при t в триссолянокислом буферном растворе при рН 7,0-8,0, образовавшуюся в результате реакции РНК отделяют от белка обычным способом, отделенную от бел, ка РНК центрифугируют с использованием CgCl в качестве амортизатора, целевой продукт осаждают этанолом и выдерживают в термостате при t 70100 С, затем быстро охлаждают до комнатной температуры или ниже. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Японии ff 2008/75t кл, 113 Е 4, 1975.