СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНО-СПЕРМАЛЬНОГО β-ГЛОБУЛИНА Российский патент 1994 года по МПК A61K35/52 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения плацентарно-спермального бета₂-глобулина (ПСБГ).

ПСБГ был выявлен в небольших количествах (до 3% ) во фракции андрогенсвязывающих белков раннего хориона человека, элюируемой с иммобилизованного через треххлортриазин на сефарозе тестостерона 0,8 М раствором хлорида натрия. При сравнительном иммунодиффузионном анализе с известными планцентарными белками ПСБГ оказался неидентичным последним. Иммунохимически данный антиген был выявлен в ткани раннего хориона, экстракте эмбриональной почки, мужской семенной плазме и ликворе недоношенных детей. Эти данные позволяют считать ПСБГ перспективно ценным маркером для мониторинга беременности и скрининга опухолей мужского репродуктивного тракта, мозга и почки. Получение очищенных препаратов плацентарно-спермального бета₂-глобулина позволит разработать высокочувствительный иммуноферментный метод определения данного белка в биологических жидкостях и тканях.

Первоначально ПСБГ был выявлен из абортного материала, полученного в акушерско-гинекологических клиниках при прерывании беременности по медицинским показаниям.

150 мл абортного материала отмывали на бюхнеровской воронке холодным физиологическим раствором от крови, извлекали ткань хориона (около 100 г), троекратно замораживали и оттаивали с 0,1% -ным тритоном Х-100, центрифугировали при 6000 об/мин в течение 45 мин надосадочную жидкость диализовали 24 ч против дистиллированной воды и 24 ч против 0,05 М трис-НСl буфера рН 8,0, повторно центрифугировали и супернатант использовали в аффинной хроматографии на тестостероне, конъюгированном через трихлортриазин на сефарозе. Элюцию фракции, содержащей ПСБГ, осуществляли 0,8 М раствором хлорида натрия, полученный алюат диализовали 24 ч против 0,05 М трис-НCl буфера рН 7,5 и подвергали ионнообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой в том же буфере. Балластные (в данном случае) белки сорбировались на анионообменнике, ПСБГ элюировался в свободном объеме, не связываясь с ДЕАЕ-целлюлозой. Фракцию, содержащую ПСБГ, собирали, диализовали против 0,1 М аммоний-бикарбонатного буфера рН 8,15 и лиофилизировали, получая препарат ПСБГ. Иммунохимический и биохимический анализы демонстрировали содержание ПСБГ с препарата около 50% , количество белка 0,1 мг.

Полученным препаратом иммунизировали кроликов и получали поликлональные моноспецифические антисыворотки к ПСБГ. С помощью этих антисывороток было установлено повышенное (в сравнении с экстрактом раннего хориона) содержание данного белка в мужской семенной плазме, которая и явилась исходным материалом для получения ПСБГ.

Целью изобретения является разработка нового способа получения очищенного препарата плацентарно-спермального бета-глобулина (ПСБГ).

Поставленная цель достигается следующим образом. Семенную плазму мужчин разбавляют в три раза дистиллированной водой с помощью 1 М раствора трис (основного) доводят рН до 8,5 - 7,5, центрифугируют, полученный супернатант подвергают аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизированным через трихлортриазин тестостероном, связавшийся белок элюируют 0,8 М хлоридом натрия, элюат диализуют против 0,02 - 0,05 М трис-НСl буфера рН 7,0 - 8,0 и подвергают ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе в том же буфере, несвязавшуюся с ионообменником фракцию белков собирают, диализуют против 0,1 М аммоний-бикарбонатного буфера и лиофилизируют, получая препарат ПСБГ 50% -ной степени чистоты.

Новым в предлагаемом способе является то, что для выделения и очистки из сложной белковой смеси ранее неизвестного белка - плацентарно-спермального бета₂-глобулина - использован биоспецифический лиганд - тестостерон, иммобилизо- ванный через трихлортриазин на нерастворимой матрице - сефарозе, причем элюат, содержащий ПСБГ фракционируют на анионообменника (ДЕАЕ-целлюлозе) в условиях, обеспечивающих сорбцию балластных белков и выход искомого белка в свободном объеме, что позволяет получить препарат ПСБГ 50% степени чистоты.

Для достижения цели изобретения выбраны и обоснованы параметрические значения способа. При разведении исходной семенной плазмы в 3 раза дистиллированной водой, суммарная ионная сила получаемой смеси не превышает 0,05, что позволяет фракционировать данный материал без предварительного диализа.

Для аффинной хроматографии ПСБГ на иммобилизированном тестостероне оптимальным значением рН для наилучшей сорбции белка оказалось значение рН 8,0 и ионная сила трис-HCl буфера 0,02; при уменьшении минимального значения рН до 7,5 и той же ионной силе буфера наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, что уменьшало выход целевого продукта. При увеличении значения рН до 8,5 количество сорбируемого белка отвечало оптимальному значению, однако при этом увеличивалось количество балластных белков, сорбирующихся на тестостероне, что уменьшало чистоту препарата.

При ионообменной хроматографии оптимальным значением для этого этапа очистки явилось рН 7,5 и ионная сила трис-НСl буфера от 0,02 до 0,05, колебания значений которой в указанных пределах не оказывали существенного влияния на чистоту и выход препарата ПСБГ. При этом уменьшение оптимального значения рН до 7,0 приводило к уменьшению чистоты препарата до 30% , а увеличение значения рН до 8,0 - к уменьшению выхода целевого продукта.

П р и м е р 1. 100 мл семенной плазмы, содержащей около 8 мг ПСБГ разбавляют 200 мл дистилированной воды, доводят 1 М трис-НСl до рН 7,5, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, супернатант используют в аффинной хроматографии на иммобилизированном тестостероне, элюируя связавшиеся белки 0,8 М раствором хлорида натрия. Полученный элюат диализуют 24 ч против 0,02 - 0,05 М трис-НСl буфера рН 7,0 и подвергают ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой в том же буфере. При этом ПСБГ элюируется в свободном объеме, не связываясь с ДЕАЕ-целлюлозой. Фракцию, содержащую ПСБГ, собирают, диализуют против 0,1 М аммоний-бикарбонатного буфера рН 8,15 и лиофилизируют. Иммунохимический и биохимический анализы демонстрируют содержание ПСБГ в препарате около 30% . Количество белка 2 мг, выход 7,5% .

П р и м е р 2. Исходным материалом для получения ПСБГ служит мужская семенная плазма. Аффинную хроматографию проводят при рН 8,5. Ионообменную хроматографию проводят в 0,05 М трис-НСl буфере при рН 8,0. Получено 1,4 г препарата белка с содержанием ПСБГ 40% . Выход 8% .

П р и м е р 3. Исходным материалом для получения ПСБГ служит мужская семенная плазма. Аффинную хроматографию проводят при рН 8,0. Ионообменную хроматографию проводят в 0,02 - 0,05 М трис-НСl буфере при рН 7,5. Получено 2,6 мг препарата белка с содержанием ПСБГ 50% . Выход 16% .

Предлагаемый способ является оригинальным способом выделения плацентарно-спермального бета₂-глобулина-белка, ранее не описанного в литературе.

При сравнительном иммунохимическом изучении ПСБГ с известными плацентарными белками, установлена неидентичность ПСБГ этим белкам. В литературе также отсутствуют данные о сходных с ПСБГ белках.

При изучении физико-химических свойств ПСБГ было установлено, что данный белок обладает электрофоретической подвижностью (относительно альбумина) - 0,3, молекулярной массой, определенной методом гель-фильтрации - 20 кД, методом электрофореза в ПААГ с ДСН - 23 кД. Белок не содержит углеводов при окрашивании дуги преципитации по методу Шиффа и осаждается сульфатом аммония при 55% насыщения.

Разработка оригинального способа выделения ПСБГ и получения к нему антисыворотки является актуальной научной задачей, так как данный белок выявлен в раннем хорионе и разработка высокочувствительного иммуноферментного метода определения ПСБГ на основе очищенных препаратов этого белка позволит получить дополнительный диагностический тест для мониторинга беременности, а также скрининга опухолей мозга и почки. Метод иммунодиффузионного анализа этого белка на основе очищенного препарата ПСБГ может быть использован как дополнительный диагностический тест в исследовании патологии мужского репродуктивного тракта.

Использование : в медицине. Способ получения плацентарно-спермального β₂-глобулина заключается во фракционировании мужской семенной плазмы на иммобилизованном через трихлортриазин тестостероне с последующей ионообменной хроматографией элюата на ДЕАЕ-целлюлозе. Целью изобретения является получение целевого продукта - плацентарно-спермального β₂-глобулина 50% -ной степени чистоты при выходе ПСБГ 16% . Возможные области применения : акушерство и гинекология, андрология, неонатология.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНО-СПЕРМАЛЬНОГО бета₂-ГЛОБУЛИНА заключающийся в том, что семенную плазму мужчин разбавляют в три раза дистиллированной водой, с помощью 1 М раствора основного трис-HCl-доводят рН до 7,5 - 8,5, центрифугируют, полученный супернатант подвергают аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным через трихлортриазин тестостероном, связавшийся с сорбентом белок элюируют 0,8 М раствором хлорида натрия элюат диализуют против 0,02 - 0,05 М и трис-HCl буферного раствора рН 7,0 - 8,0 и подвергают ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе в том же буферном растворе, несвязавшуюся с ионообменником фракцию белков собирают, диализуют против 0,1 М аммонийно-бикарбонатного буферного раствора и лиофилизируют.