СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНО-СПЕРМАЛЬНОГО ГАММА-ГЛОБУЛИНА Российский патент 1995 года по МПК A61K35/48 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения плацентарно-спермального гамма-глобулина (ПСГГ).

В литературе этот белок не описан и способов его получения к настоящему времени в патентной и медицинской литературы не найдено.

ПСГГ обнаружен в экстракте раннего хориона, мужской семенной плазме, спинно-мозговой жидкости и может служить индикатором состояния фетоплацентарной и мужской репродуктивной систем, а также центральной нервной системы. Данный белок выявлен также в экстракте эмбриональной почки, и тест на этот антиген может быть использован для скрининга заболеваний почки.

В предлагаемом изобретении в качестве лиганда использован конго-красный краситель, иммобилизованный на сефарозе через эпсилон-аминокапроновую кислоту. В литературе отсутствуют какие-либо данные о применении аналогичного лиганда в очистке белков. В связи с этим можно считать, что предлагаемое изобретение не имеет аналогов, прототип отсутствует.

При использовании для аффинной хроматографии в качестве исходного биологического материала водного экстракта раннего хориона, в препарате белков, связывающих краситель, был выявлен в небольших количествах (до 1%) антиген с подвижностью γ -глобулина и молекулярной массой около 40 кД. При сравнительном иммунодиффузионном анализе с известными плацентарными белками каких-либо перекрестных реакций выявлено не было. Иммунохимически данный антиген был обнаружен (кроме ткани раннего хориона) в экстракте эмбриональной почки, мужской семенной плазме и ликворе недоношенных детей. Эти данные дают основание считать ПСГГ перспективно ценным маркером для мониторинга беременности и скрининга заболеваний мозга, почки и мужского репродуктивного тракта.

Целью изобретения является получение очищенного препарата плацентарно-спермального γ -глобулина, достигаемое следующим образом: семенную плазму разбавляют в три раза дистиллированной водой, доводят рН до 8,5-7,5 1,0 М раствором основного трис-а, центрифугируют и подвергают аффинной хроматографии на иммобилизованном конго-красном красителе, для чего сефарозу последовательно обрабатывают трихлортриазином, ε -аминокапроновой кислотой и конго-красным красителем в присутствии карбодиимида, через полученный сорбент пропускают супернатант семенной плазмы, связавшиеся с сорбентом белки элюируют 0,25 М раствора хлорида натрия, элюат диализуют против 0,02-0,05 М трис-HCl буфера рН 7,0-8,0 и подвергают ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, уравновешенной тем же буфером, несвязавшуюся с ионообменником фракцию белков диализуют против 0,1 М аммонийбикарбонатного буфера рН 8,15 и лиофилизируют, получая целевой продукт ПСГГ 58% степени чистоты.

Сорбент синтезировали следующим образом.

50 мл сефарозы 6В отмывали на фильтре 500 мл дистиллированной воды и слегка отжимали на фильтре, далее суспендировали в 50 мл ацетона, в котором непосредственно перед этим растворяли 2 г трихлортриазина (цианурхлорида). Полученную суспензию помещали в колбе на магнитную мешалку и при медленном вращении добавляли по каплям 10%-ный раствор едкого натра, поддерживания рН около 8,5. Как только рН среды начинал смещаться в щелочную сторону, приближаясь к 9,0, добавление щелочи прекращали, выжидали 5 мин и реакцию останавливали, добавляя в суспензию 50 мл охлажденной 25%-ной уксусной кислоты. Полученную проактивированную сефарозу отмывали от несвязавшегося трихлортриазина и уксусной кислоты 1 л 50%-ного водного раствора ацетона и 1 л дистиллированной воды на фильтре на бюхнеровской воронке.

Проактивированную таким образом сефарозу помещали в колбу, добавляя 50 мл дистиллированной воды, 1 г ε -аминокапроновой кислоты и 1 г карбоната натрия, тщательно перемешивали и оставляли на ночь на магнитной мешалке при медленном перемешивании. На следующий день полученный продукт отмывали на фильтре 2 л дистиллированной воды.

50 мл сефарозы с введенной ε -аминокапроновой кислотой переводили в диоксан, помещали в химический стекан, добавляли 50 мл диоксана, 1 г конго-красного красителя. 2 г дициклогексилкарбодиимида, 1 мл пиридина, смесь оставляли при медленном перемешивании на магнитной мешалке на ночь, после чего последовательно отмывали на фильтре 2 л диоксана, 2 л 50%-ного водного диоксана, 2 л 50%-ного водного этанола, 2 л дистиллированной воды, после чего сорбент отмывался от несвязавшегося красителя, оставаясь розового цвета. На этом сорбенте проводили выделение ПСГГ и эксперименты по его аффинной хроматографии.

На полученный препарат ПСГГ приготавливали кроличьи поликлональные, моноспецифические антисыворотки.

Новым в предлагаемом способе является то, что для выделения и очистки из сложной белковой смеси ранее неизвестного белка - плацентарно-спермального γ -глобулина использован новый биоспецифический лиганд - конго-красный краситель, иммобилизованный через трихлортриазин- ε-аминокапроновую кислоту на сефарозе, причем элюат, содержащий ПСГГ, фракционируют на анионообменнике (ДЕАЕ-целлюлозе) в условиях, обеспечивающих сорбцию балластных белков и выход искомого белка в свободном объеме, что позволяет получить препарат ПГСС 50% степени чистоты.

Для достижения цели изобретения нами выбраны и обоснованы параметрические значения способа.

Так, при разведении исходного биологического материала - семенной плазмы в 3 раза дистиллированной водой суммарная ионная сила получаемой смеси не превышает 0,05, что позволяет фракционировать данный материал без предварительного диализа: разбавление в большее количество раз уменьшает сорбцию ПСГГ на сорбенте и приводит к меньшему выходу целевого продукта; тот же эффект наблюдается и при разбавлении в меньшее количество раз - сорбция ПСГГ снижена вследствие увеличения ионной силы исходного биологического материала.

Для аффинной хроматографии ПСГГ на иммобилизованном конго-красном красителе оптимальным для наилучшей сорбции белка оказалось значение рН в интервале 8,5-7,5 и ионная сила трис-HCl буфера 0,02-0,05; при уменьшении значения рН ниже 7,5 наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, что уменьшало выход целевого продукта; при увеличении значения рН выше 8,5, наблюдалось увеличение сорбции балластных белков, что уменьшало чистоту препарата.

При ионообменной хроматографии оптимальным значением рН было значение 7,0-8,0 и ионная сила трис-HCl буфера от 0,02 до 0,05, колебания значений которой не оказывали существенного влияния на чистоту и выход препарата ПГСС; при этом уменьшение оптимального значения рН менее 7,0 приводило к уменьшению чистоты препарата до 40%, а увеличение значения рН более 8,0 приводило к уменьшению выхода препарата до 8,3%.

Предварительные эксперименты с абортным материалом были проведены следующим образом.

150 мл абортного материала отмывали на бюхнеровской воронке холодным физиологическим раствором, отбирали кусочки ткани хориона (около 100 г), троекратно замораживали и оттаивали с добавлением 0,1% тритона Х-100, центрифугировали при 6000 об/мин в течение 45 мин, супернатант диализовали 24 ч против дистиллированной воды и 24 ч против 0,02-0,05 трис-HCl буфера рН 8,5-7,5. После повторного центрифугирования супернатант подвергали аффинной хроматографии на иммобилизованном через ε -аминокапроновую кислоту на сефарозе конго-красный краситель. Связавшиеся белки элюировали 0,25 М раствором хлорида натрия, элюат диализовали 24 ч против 0,02-0,05 М трис-HCl буфера рН 8,0-7,0 и наносили на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Балластные белки сорбировались на анионнообменнике, ПСГГ выходил в свободном объеме, не связываясь с ДЕАЕ-целлюлозой; полученную фракцию диализовали 24 ч против 0,1 М аммонийбикарбонатного буфера рН 8,15 и лиофилизировали, получая препарат ПСГГ с содержанием этого белка 30%, общего белка 0,15 мг.

При иммунохимическом исследовании содержания ПГСС в различных биологических жидкостях и экстрактах тканей высокий процент содержания этого белка был выявлен в мужской семенной плазме, которая была использована для дальнейшего выделения ПСГГ.

П р и м е р 1. 100 мл мужской семенной плазмы с содержанием ПСГГ 60 мл/л смешивают с 200 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин и супернатант используют в аффинной хроматографии на иммобилизованном конго-красном красителе при рН 7,5. Ионообменную хроматографию проводят в 0,02-0,05 М трис-HCl буфере при рН 7,0. Получают 1,5 мг белка с содержанием ПСГГ 40%. Выход 10%.

П р и м е р 2. Мужскую семенную плазму обрабатывают, как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят при рН 8,5. Ионообменную хроматографию проводят в 0,02-0,05 М трис-HCl буфере при рН 8,0. Получают 1 мг белка с содержанием ПГСС 50%. Выход 8,3%.

П р и м е р 3. Мужскую семенную плазму обрабатывают, как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,02-0,05 М трис-HCl буфере при рН 8,0. Связавшиеся белки элюируют 0,25 М раствором хлорида натрия. Элюат диализуют 24 ч против 0,02-0,05 М трис-HCl буфера и используют в ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе при рН 7,5. Получают 1,8 мг белка с содержанием ПСГГ 50%. Выход 15%.

Предлагаемый способ является оригинальным способом выделения и очистки ПСГГ - белка, ранее не описанного в литературе. Проведенный сравнительный иммунохимический анализ и изучение литературных данных свидетельствуют об отличии ранее описанных плацентарных и спермальных белков от ПСГГ. При изучении физико-химических свойств ПСГГ было установлено, что белок обладает электрофоретической подвижностью γ -глобулина, имеет молекулярную массу в гель-фильтрации 40 кД, в электрофорезе с ПААГ с ДСН - 35 кД; дает отрицательную реакцию при окрашивании дуги преципитации на углеводный компонент (шифр-йодная реакция) и осаждается при 50% насыщения сульфатом аммония.

Разработка способа выделения ПСГГ и получения к нему антисыворотки является актуальной научной задачей, так как данный белок найден в ткани ранней плаценты, в экстракте эмбриональной почки, ликворе и семенной плазме. Создание высокочувствительного иммуноферментного метода определения ПСГГ на основе очищенных препаратов этого белка позволит получить дополнительный диагностический тест для скрининга и мониторинга заболеваний мозга, почки, мужской репродуктивной системы.

Предложен способ получения плацентарно-спермального гамма-глобулина, заключающийся во фракционировании мужской семенной плазмы на иммобилизованном через трихлортриазин ε - аминокапроновую кислоту конго - красном красителе с последующей ионообменной хроматографией элюата на ДЕАЕ - целлюлозе. Целью изобретения является получение целевого продукта плацентарно-спермального g -глобулина 50% -ной степени чистоты при выходе ПСГГ 15%. Возможные области применения: акушерство и гинекология, андрология, неснатология.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНО-СПЕРМАЛЬНОГО ГАММА-ГЛОБУЛИНА, отличающийся тем, что семенную плазму мужчин разбавляют в три раза дистиллированной водой, доводят до рН до 6,5-7,5 с помощью 1 М раствора основного трис-а, центрифугируют и подвергают аффинной хроматографии на иммобилизованном конго-красном красителе, для чего сефарозу последовательно обрабатывают трихлортриазином, эпсилон-аминокапроновой кислотой и конго-красным красителем в присутствии карбодиамида, далее через полученный сорбент пропускают супернатант семенной плазмы, связавшиеся с сорбентом белки элюируют 0,25 М раствором хлорида натрия, элюат диализуют против 0,02-0,05М трис-HCl буфера рН 7,0-8,0 и подвергают аффинной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, уравновешенной тем же буфером, не связавшуюся с ионообменником фракцию белков диализуют против 0,1 М аммоний-бикарбонатного буфера рН 8,15 и лиофилизируют, получая целевой продукт.