СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОРИОНИЧЕСКОГО α - ГЛОБУЛИНА Российский патент 1994 года по МПК A61K35/50 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения хорионического α_o-глобулина, белка, идентифицированного в раннем хорионе человека, секретируемого в кровь беременных в первой половине беременности и могущего служить индикатором состояния фероплацентарной системы и, следовательно, быть использованным для диагностики и прогнозирования течения беременности.

Кроме сывороток крови беременных, хорионический α_o-глобулин обнаружен в сыворотках крови больных трофобластическими опухолями. Белок был выявлен при иммунохимическом изучении фракции андрогенсвязывающих белков раннего хориона человека, полученного при прерывании беременности до 12 недель по медицинским показаниям.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения этого белка, включающий аффинную хроматографию экстракта раннего хориона на тестостероне, связанном с обработанной трихлортриазином сефарозой, элюцию связывающихся 0,8-4,0 М раствором хлорида натрия, диализ элюата против 0,01-0,02 трис-НСl-буфера рН 8,0-9,0 и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе в том же буфере диализ несвязавшейся в анионообменником фракции против 0,1 М аммоний-бикарбонатного буфера и лиофилизацию (А. С. N 1510138). При этом в качестве целевого продукта получен препарат ХАГ с чистотой 50% . Выход белка составил 1,0 мг на 1000 г ткани хориона.

Перспективность использования теста на этот белок была доказана находкой в 80% случаев в сыворотке крови больных хорионэпителиомой матки и корреляцией пониженного содержания ХАГ в сыворотке крови беременных в первом триместре с угрозой прерывания беременности.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта - хорионического α_o-глобулина.

Поставленная цель достигается способом получения хорионического α_o-глобулина, включающем аффинную хроматографию на иммобилизованных андрогенах с последующей ионообменной хроматографией элюата, диализом и лиофилизацией, причем согласно изобретению с целью увеличения выхода целевого продукта, ткань хориона предварительно обрабатывали 5-10% -ным бутиловым спиртом, центрифугировали, отбирали водно-белковую фазу, которую диализовали против 0,01-0,05 М трис-НСl буфера рН 8,0-9,0 и подвергали аффинной хроматографии на сорбенте, который получали путем последовательной обработки сефарозы трихлортриазином, эпсилон-аминокапроновой кислотой и тестостероном в присутствии карбодиимида, а содержащий целевой продукт элюат диализовали перед ионообменной хроматографией против 0,02-0,05 М трис НСl буфера рН 7,5-8,5.

Сорбент синтезировали следующим образом.

50 мл сефарозы 6В отмывали 500 мл дистиллированной воды и слегка отжимали на фильтре, далее суспендировали в 50 мл ацетона, в котором непосредственно перед этим растворяли 2 г трихлортриазина (цианурхлорида). Данную суспензию помещали на магнитную мешалку в колбе и при медленном перемешивании добавляли по каплям 10% -ный раствор едкого натра, поддерживая рН около 8,5. Как только рН среды начинал смещаться в щелочную сторону, приближаясь к 9,0. добавление щелочи прекращали, выжидали 5 мин и реакцию прекращали, добавляя к суспензии 50 мл охлажденной 25% -ной уксусной кислоты. Полученную проактивированную сефарозу отмывали от несвязавшихся трихлортриазина и уксусной кислоты 1 л 50% -ного водного раствора ацетона и 1 л дистиллированной воды на фильтре на бюжнеровской воронке.

Далее проактивированную таким образом сефарозу помещали в колбу, добавляли 20 мл дистиллированной воды, 1 г эпсилон-аминокапроновой кислоты и 1 г бикарбоната натрия, тщательно перемешивали и оставляли на магнитной мешалке на ночь при медленном перемешивании. На следующий день полученный продукт отмывали на фильтре 2 л дистиллированной воды, после чего проводили конъюгацию аминопроизводного сефарозы с тестостероном.

50 мл сефарозы с введенной эпсилон-аминокапроновой кислотой переводили в диоксан, помещали в химический стакан и добавляли 50 мл диоксана, 1 г тестостерона, 2 г карбодиимида (дициклогексил) и 1 мл пиридина, смесь перемешивали и оставляли при медленном вращении на магнитной мешалке на ночь, после чего отмывали на фильтре последовательно 2 л диоксана, 2 л 50% -ного водного раствора диоксана, 2 л 50% -ного водного раствора этанола, 2 л дистиллированной воды, после чего получали сорбент, годный к употреблению.

Новым в предлагаемом способе является то, что ткань раннего хориона обрабатывают 5-10% -ным раствором бутилового спирта, что позволяет упростить процедуру экстракции, достичь более полного разрушения обрабатываемой ткани, а также способствует ее дестероилизации. Новым в предлагаемом способе является и то, что аффинный лиганд-тестостерон иммобилизован с применением удлиненного на 1 нм (по сравнению с прототипом) спейсера - эпсилон-аминокапроновой кислоты, что позволяет повысить стерическую доступность лиганда, приводящую к увеличению сорбционной емкости сорбента и увеличению выхода целевого продукта.

Для достижения цели изобретения нами выбраны и обоснованы параметрические значения способа. Так, для обработки ткани хориона бутиловым спиртом оптимальной оказалась концентрация реагента 7% , причем при уменьшении минимального значения менее указанной цифры происходила неполная экстракция хорионического α_o-глобулина, а при увеличении максимального значения более указанной цифры в супернатанте после центрифугирования бутанольного экстракта хориона создавался избыток бутилового спирта, что приводило к увеличению процедуры диализа до 72 ч.

При аффинной хроматографии оптимальным значением рН для наилучшей сорбции ХАГ на иммобилизованном лиганде оказалось значение рН 8,5 и ионная сила трис-НСl буфера 0,02; при уменьшении минимального значения рН до 8,0 и молярности буфера до 0,01 наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, что уменьшало выход целевого продукта; при увеличении значения рН до 9,0 и молярности буфера 0,05, количество сорбируемого белка отвечало оптимальному значению, однако при этом увеличивалось количество сорбируемых балластных белков, что уменьшало чистоту препарата.

При ионообменной хроматографии оптимальным значением для этого этапа очистки являлось рН 8,0 и ионная сила трис-HCl буфера 0,02. Выход целевого продукта при этом составил 27,5% . При уменьшении оптимального значения рН до 7,5 и ионной силе трис-HCl буфера 0,02 выход белка (ХАГ) составил 15% ; при увеличении рН до 8,5 и ионной силы до 0,05 выход ХАГ составил 20% .

П р и м е р 1. 500 мл абортного материала отмывают на бюхнеровской воронке холодным физиологическим раствором, извлекают кусочки хориона (около 500 г), смешивают с равным объемом 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,0, обрабатывают 5% -ным бутиловым спиртом в течение 1 ч при +4^о С, периодически помешивая, и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 45 мин. Супернатант диализуют 24 ч против дистиллированной воды и 24 ч против 0,01 трис-HCl буфера рН 8,0, вновь центрифугируют и используют для аффинной хроматографии, на тестостероне, конъгированным через эпсилон-аминокапроновую кислоту на сефарозе. Связавшиеся белки элюируют 0,1 М раствором хлорида натрия, в этой фракции с сорбента элюируются балластные белки, и 2,0 М раствором хлорида натрия - фракцию, содержащую ХАГ, Полученный элюат диализуют 24 ч против 0,02 М трис-HCl буфера рН 7,5 и наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой в том же буфере. Хорионический α_o-глобулин элюируется в свободном объеме, не связываясь с анионообменником; фракцию, содержащую этот белок, отбирают диализуют против 0,1 М аммоний-бикарбонатного буфера рН 8,5 и лиофилизируют, получая препарат хорионического α_o-глобулина. Иммунохимический и биохимический анализ демонстрирует содержание ХАГ в препарате около 30% . Количество белка 2,0 мг, выход 15% .

П р и м е р 2. Ткань хориона обрабатывают 10% -ным бутиловым спиртом. Аффинную хроматографию проводят в 0,05 М трис-HCl буфере рН 9,0. Ионообменную хроматографию - в 0,05 М трис-HCl буфере рН 8,5. Получено 2,3 мг препарат белка с содержанием ХАГ около 40% . Выход 23% .

П р и м е р 3. Ткань хориона обрабатывают 7% -ным бутиловым спиртом. Аффинную хроматографию проводят в 0,02 М трис-HCl буфере рН 8,5. Ионообменную хроматографию проводят в 0,02 М трис-HCl буфере рН 8,0. Получено 2,2 мг препарата белка с содержанием ХАГ около 50% . Выход 27,5% .

Предлагаемый способ является оригинальным выделением хорионического α_o-глобулина, идентифицированного в ткани раннего хориона человека в 1988 г. (А. С. N 1510138) и позволяет, используя большую стерическую доступность биоспецифического лиганда для ХАГ - тестотерона, достигаемую увеличением длины спейсера - эпсилон-аминокапроновой кислоты на 1 нм по сравнению с ранее предложенной, достичь 100% -ного увеличения выхода конечного продукта - хорионического α_o-глобу- лина.

Использование данного технического решения позволит увеличить лабораторное производство ХАГ, а это в свою очередь позволит получить большее количество антисыворотки к этому белку и использовать ее для выпуска опытных партий иммунодиффузионного диагностикума на ХАГ.

Разработка способа выделения ХАГ и получения к нему антисыворотки является актуальной научной задачей, так как данный белок выявлен в сыворотке крови беременных в первом триместре беременности и пониженное его содержание (менее 2 мг/л) в период с 5 по 10 недели беременности служит неблагоприятным прогностическим признаком спонтанного раннего прерывания беременности (выкидыша). Выявление ХАГ в сыворотке крови больных с хорионэпителиомой матки указывает на возможность использования теста на этот белок для диагностики и контроля эффективности проводимого лечения. (56) Авторское свидетельство СССР N 1510138, кл. А 61 К 35/50, 1989.

Предложен способ получения хорионического α_o - глобулина, заключающийся во фракционировании бутанольного экстракта раннего хориона человека на иммобилизованном через трихлортриазинэпсилон-аминокапроновую кислоту тестостероне с последующей ионообменной хроматографией элюата на ДЕАЕ- целлюлозе. Целью изобретения является получение целевого продукта - хорионического α_o - глобулина 50% -ной степени чистоты при выходе ХАГ 27,5% . Возможные области применения: акушерство и гинекология, андрология.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОРИОНИЧЕСКОГО α₀-ГЛОБУЛИНА, включающий аффинную хроматографию на иммобилизованных андрогенах с последующей ионообменной хроматографией элюата, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, ткань раннего хориона обрабатывают 5 - 10% -ным раствором бутилового спирта, центрифугируют, водно-белковую фазу диализуют против 0,01 - 0,05 трис-HCl буферного раствора pH 8 - 9 и подвергают аффинной хроматографии на сорбенте, который получают путем последовательной обработки сефарозы трихлортриазином, эпсилон-аминокапроновой кислоты и тестостероном в присутствии карбодиамида, а содержащий целевой продукт элюат диализуют перед ионообменной хроматографией против 0,02 - 0,05 М трис-HCl буферного раствора pH 7,5 - 8,5.