Способ получения ферментного препарата L-лизиндекарбоксилазы Советский патент 1988 года по МПК C12N9/88 C12N9/96 

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, в частности к производству ферментов, и каса- ется получения ферментного препарата лизиндекарбоксилазы - аналитической композиции, используемого в качестве реагента для определения концентрации L-лизина в растворах при работе автоматического L-аминокислотного анализатора.

.Цель изобретения - увеличение ферментативной активности и стабильности.

На чертеже показана зависимость остаточной лизиндекарбоксилазной ак- тивности биомассы, высушенной разными способами, от продолжительности хранения, где кривая 1 - биомасса, обработанная ацетоном и эфиром (по известному способу); кривая 2 - биомасса, обработанная ацетоном без эфира (по предлагаемому способу).

Способ заключается в том, что понижение в 2 раза концентрации пептона и глюкозы в питательной среде, отказ от насыщения воздухом питательной среды и перемешивания культураль- ной жидкости во время ферментации, сужение интервала температуры выращивания биомассы до 30-32 взамен 30- 34 С и укорочение времени культивирования бактерий до 3-3,5 вместо 4 - 5,5 ч позволяет повысить лизиндекар- боксилазнуто активность препарата в 1,3 раза при применении 250-литровык ферментеров и в 3 раза при укрупненном производстве с применением 1500- литровых ферментеров. Кроме значительного повьшения тшзиндекарбокси- лазной активности в последнем случае в препарате -отсутствует индуцируемая глутамино вой кислотой, которую содержит пептон, глутаматдекарбоксилазная активность, появляющаяся в аэробных условиях.

Улучшение условий техники безопасности при ацетонировании биомассы достигнуто путем применения меньшего (в 4 раза) количества ацетона (легко возгорающейся жидкости) взамен его 18-20-кратнбго объема, а также отказа от промывания ацетонированной биомассы ацетоном и эфиром, обладающим сильным наркотическим действием, При этом лизиндекарбоксилазная активность ацетонированных клеток повышается в 1,3 раза, а стабильность при хранении - в 1,5 раза.

Компоненты препарата лизиндекарбо- ксипазы - аналитической композиции - ацетонированная биомасса клеток продуцента лизиндекарбоксилазы, одно- и двузамещенные фосфаты натрия,растворимый крахмал, глюкоза и стеарат кальция в соотношении, мас.%: 12:45, 4:3, 2:30, 4:8:1, позволяют получить

при помощи таблеточного пресса таблетки, растворяющиеся в 1 мл анализируемой жидкости при 40-50 С и пе- ремепшвании в течение 0,5-1,0 мин с образованием буферного раствора с

рН 5,5 и лизиндеркабоксилазной активностью не менее 4 ед/мл, т.е. обладающие свойствами, необходимыми при работе автоматического анализатора лизина при серийных анализах.

Пример. Музейную культуру пе- рассевают на 2%-ный мяср-пептонный агар (МПА) в чашки Петри и инкубируют в термостате при 30 С 24 ч. Оживленную культуру пересевают на косяки МПА в 30 пробирках и инкубируют при 30°С 24 ч. Культуру, выросшую на косяках, далее вьфащивают в среде объемом 3,750 л, содержащей, мас.%: глюкоза 0,4; пептон 0,1; кормовой

лизин кристаллический 0,8; натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,23; калий однозамещенный фосфорнокислый 0,53; натрий хлористый 0,1, рН среды 6,4. При подготовке среды раствор

глюкозы стерилизз от при 0,5 атм

30 мин, а смесь растворов остальных компонентов - при 1 атм 20 мин. Культуру инкубируют при 30 С 5 ч и ис- польззтот для приготовления инокулята в сателлите, содержащего 37,5 Л питательной среды того же состава. Инокулят выращивают при 32 С до оптической плотности 0,8 при 540 нм и толщине слоя 0,5 см. Инокулят засевают в ферментер объемом 1500 л, содержащий 710л питательной среды с рН 6,3. Ферментацию проводят при 31°С без перемешивания и подачи воздуха со свободным падением рН до 6,0 до образования оптической плотности среды 0,4 при 540 нм и толщине слоя 0,5 см. Суспензию клеток хлаждают до и биомассу отцентрифугируют при 17000 об/мин. Получают 900 г сырой биомассы. Измеряют активность биомассы после ее дезинтеграции ультразвуком при следующих условиях,: рН 5,7j 37 Cj концентрация субстрата 0,05 М, пиридоксальфосфата 0,05 мМ.

Лизиндекарбоксилазная активность биомассы составляет 10 ед/мг сухого ве- ,щества, удельная активность 32 ед/мг белка, глутаматдекарбоксилазная ак- тивность не обнаруживается.

Ацетонирование биомассы проводят порциями по 70 г. К навеске биомассы добавляют 10 мл физиологического раствора и в ледяной бане размешива- ют до получения однородной суспензии в которую при перемешивании приливают 350 мл охлажденного до +4°С ацетона, перемешивают .10 мин, фильтруют на вакуум-фильтре и высушивают на воздухе.

Необходимые комоненты аналитической композиции в количестве 33 г аце- тонированных клеток, 124,8 г натрия фосфорнокислого однозамёщенного, 8,7 г фосфорнокислого двузамещенного 83,6 г растворимого крахмала, 22 г глюкозы, 2,75 г стеарата кальция перемешивают до образования однородной массы и таблетируют на прессе ПЛТ-1 с пресс-инструментом ф5 мм. Применяется такое давление прессования, при котором время распадаемости таблетки в 1 МП воды при 42 С и перемешивании не превышало 1,О мин.

Значение рН образовавшейся суспензии соответствует 5,5 лизиндекарбо- ксилазная активность - 13 ед/мл.

Пример приведен при одних значениях параметров, так как в границах допустимых колебаний результат - качество аналитической композиции - не меняется.

Влияние аэрации на лизиндекарбо- ксилазную активность биомассы и об- разование сопутствующей глутаматде- карбоксилазной активности показано в табл. 1.

При выращивании продуцента в 1500-литровых ферментерах (масштабирование около 8 раз) по предлагаемому способу Лизиндекарбоксилазная активность сырой биомассы, а также после ее ацетонирования в среднем в 3 раза выше, чем по известному способу Кроме того, в биомассе не содержится нежелательная .примесь глутаматдекар боксилазы. Это объясняется тем, что при ферментации в больших объемах , (1500 л) перемешивание и насыщение воздухом питательной среды приводит к появлению сопутствующей глутамат- декарбоксилазной активности и снижению лизиндекарбоксилазной активности.

SasHciiMocTb лизиндекарбоксилазной активности биомассы от количества ацетона показано в табл. 2.

Для ацетонирования биомассы, суспендированной в минимальном количестве физиологического раствора в соотношении 7:1 соответственно, необходимо использовать 4-6-кратный объем ацетона.

Последующая обработка ацетониро- ванной. биомассы эфиром ухудшает стабильность лизиндекарбоксилазной активности при хранении (см.чертеж).

Как видно из чертежа, при хранени в течение года остаточная активность биомассы, обработанной ацетоном согласно изобретению, в 1,5 раза вьш1е, чем по известному способу. Поэтому для повьш1ения стабильности лизиндекарбоксилазной akтивнocти следует отказаться от досушивания ацетониро- ванной биомассы эфиром.

Использование предлагаемого способа получения ферментного препарата лизиндекарбоксилазы - аналитической композиции - дает следующие преимущества:

. При выращивании продуцента лизин- декарбоксипазы в 1500-литровых ферментерах, т.е. при масштабировании процесса ферментации в 8 раз, можно получить в 3 раза более активную биомассу.

Сокращается время, энергозатраты и упрощается подготовка питательной среды для ферментации. Так, стерилизация растворов лизина, пептона, одно- и двузамещенных фосфатов натрия, хлористого натрия производится совместно, что особенно важно при больших объемах растворов. Для получения посевного материала требуется засев культурой 30 пробирок (вместо 60). Питательная среда не продувается воздухом в течение 35 мин и не перемешивается, что позволяет экономить время и энергию.

Питательная среда содержит в 2 ра за меньше глюкозы (0,4 вместо 0,8%) и в 2 раза меньше пептона (0,1 вместо 0,2%), что позволяет экономить пищевое сырье и удешевить процесс ферментации, а также исключить индуцирование глутаматдекарбоксилазной активности.

Отказ от насьпцения воздухом пита- 1|ельной среды и перемегшвания во вре ферментации при ее масштабирова- в 8 раз позволяет избежать обра- з|ования сопутствующей глутаматдекар- фксилазы.

Ацетонирование биомассы произво- Д|Ится А-6-кратным (вместо 18-20) объемом ацетона, являющегося легко возгорающейся жидкостью (ЛВЖ), без применения эфира (ЛВЖ, сильный наркотик чго значительно сокращает расход материалов и улучшает услювия техники безопасности работающих.

I За счет изменения условий ацетони р звания биомассы стабильность лизин- дакарбоксилазной активности при хрангнии возрастает в 1,5 раза, а активность - в 1,3 раза.

При таблетировании аналитической к мпозиции используются клетки, аце- т нированные 4-6 объемами ацетона, что позволяет избежать значительной (до 40%) инактивации ферментативной а1стивности, которая обычно происхо- Д1(1Т при таблетировании ферментов.

i Применение ферментного препарата - аналитической композиции - позволяет автоматизировать процесс выполнения анализов. Препарат предназначен в качестве реактивов для серийных ана- шгзов, вьшолняемых при помощи автоматического анализатора лизина, в П1| отивоположность препарату лизинде- к рбоксилазы, ползд енному по извест- способу и используемому для одиночных Анализов, вьтолняемых вручную Состав и соотношение ко1 Отонентов ана Л1| тической композиции позволяет обес П€|чить необходимый рН (5,5) и лизин- д€|карбоксилазную активность (не ме- Н€|е 4 ед/мл) в анализируемых пробах культуральной жидкости. Это позволяет исключить взвешивание на аналитических весах ферментного препарата ПИИ каждом единичном анализе, приготовление буферов, контроль в каждой анализируемой пробе значения рН.

фосфорнокислый однозамещенный в количестве 0,52-0,54 мас,%, натрий хло- ристьй в количестве 0,09-0,11 мас.%,

пептон, лизин кормовой кристаллический в количестве 0,78-0,82 мас.%, дистиллированную воду при рН 6,0-6,2 с последующим отделением клеток центрифугированием и ацетонированием биомассы, отличающийся тем, что, с целью увеличения ферментативной активности и стабильности, про цесс культивирования проводят в анаэробных условиях до достижения оптической плотности культуральной жидкости 0,4-0,45, причем количества глюкозы и пептона устанавливают соответственно равными 0,35-0,40 и 0,09-0,11 мас.%, ацетонирование биомассы ведут 4-6-кратным объемом ацетона, полученные ацетонированные клетки смешивают с безводным одно- замеЩенным фосфатом натрия, двуза- мещенным фосфатом натрия, растворимым крахмалом, глюкозой, стеаратом кальция в соотношении, мас.%: 12:45, 4:3, 2:30, 4:8:1 соответственно, и таблетирзтат при давлении, обеспечивающем распадаемость таблеток в воде при 40-50 С в течение 0,5-1,0 мин.

i

Таблица 1

„

45

Извест

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения - увеличение ферментативной активности и стабильности. Для получения ферментного препарата ли- зиндекарбоксилазы - аналитической композиции - проводят глубинное культивирование бактерий Escherichia coli MRE 600 в питательной среде, содержащей, мас.%: глюкоза 0,35-0,4; пептон 0,09-0,11; лизин кормовой кристаллический 0,78-0,82; натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,22-0,24; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,52- 0,54; натрий хлористый 0,09-0,11. Выращивание проводят в анаэробных условиях без насыщения питательной среды воздухом и ее перемешивания при рН 6,0- 6,2 и температуре 30-32 С до достижения оптической плотности культураль- ной жидкости, 0,4-0,45 (540 нм, 0,5см). Отцентрифугированную биомассу ацето- нируют 4-6-кратным объемом ацетона. Аце- тонированные клетки смешивают с безводным однозамещеннымфосфатом натрия,дву- замещенным фосфатом натрия,растворимым крахмалом, глюкозой, стеаратом кальция в соотношении, мас.%: 12:45,4:3,2: :30,4:8:1 соответственно, и таблети- руют при давлении, обеспечивающем рас- падаемость таблеток в воде при 40 - 50 С в течение 0,5-1,0 мин. 1 ил. 2 табл. (Л 4 О9 СО СО 00

Формула изобретения

Способ получения ферментного пре- najpaTa L-лизиндекарбоксилазы путем гл|убинного культивирования продуцента Escherichia .coll MRE 600 в пита- те|льной среде, содержащей ггпокбзу, натрий фосфорнокислый дЕ1узамещенный в Количестве 0,22-0,24 масД, калий

(Насыщение питательной среды воздухом 10 в течение 35 мин и перемешивание 200 об/ /мин во время ферментации. Без насыщения воздухом и перемешивания f

Таблица 2