Питательная среда для получения @ -маннаназы Советский патент 1982 года по МПК C12N1/20 

1

Изобретение относится к микробио- логической промышленности и может быть использовано при получении ферментного препарата -маннаназы.

Известна питательная среда для получения |%-маннаназы на Bacillus subtills G-7B, содержащая картофельный крахмал, кукурузньй экстракт, пивные дрожжи и минеральные компоненты:аммоний фосфорнокислый двухзамещенный, д магний сернокислый, марганец сернокислый, калий сернокислый, хлористый кальций и воду Г ЗНедостатком данной среды является низкая продуктивность в отношении J5 фермента |Ь-маннаназы, активность которого 3,5-t,0 Е/мл при продолжительности культивирования 20-2 ч.

Цель изобретения - увеличение активности выхода целевого продукта и 20 снижение его себестоимости.

Поставленная цель достигается тем, что среда, содержащая картофельный крахмал, жидкий кукурузный экстракт,i

двухзамещенный фосфорнокислый натрий; сернокислый аммоний, сернокислый марганец пятиводный, сернокислый магний, сернокислый калий, хлористый кальций, гидроокись натрия и воду,дополнительно содержит муку из семян люцерны или муку из корней эремуруса в, качестве индуктора при следующем соотношении компонентов, мае. %: Картофельный крахмал5,5-5,7 Жидкий кукурузный экстракт3,,6 Двухзамещенный фосфорнокислый

натрий0,5-0,50

Сернокислый аммоний0,,28 Сернокислый марганец пятиводный 0,09-0,1 Сернокислый магний 0,019-0,021 Сернокислый калий 0,29-0,31 Хлористый кальций 0,,021 Гидроокись натрия 0,06-0,07

Люцерновая мука б,9. или мука из корней эрёмуруса0,,6

ВодаОстальное

Питательную среду для получения рг-маннаназы предлагаемого состава получают путем последовательной оптимизации исходной питательной среды с применением математических методов планирования эксперимента. На последнемэтапе оптимизации питательной среды, равно как и в начале работы, изучается индукция образования маннаназы бактериями Bacillus subtilis IG-78 путем включения в питательную среду субстрата (галактоманнана или глюкоманнана.

Результаты опытов представлены в табл. 1. 1

Т а б л и ц а 1

Исходная (известная)

Галйктоманнан

Исходная Глюкоман(извест- нан ная)

имечание,

Опыты 1, 6 и 7 проводят в пятикратной повторности, опыты 2, 3, k и S проводят в трехкратной повторности. X - среднее арифметическое, БХ среднеквадратическая ошибка.

Такой эффект объясняется тем,что |3гманнаназа штамма Baccillus subtilis 0-78 является индуцируемым ферментом, а состав полученной среды обуславливает индуцирующий эффект галактоманнана и глюкоманнана.

3,8iO,3 б2±4,2 0,25 20,111,6 59t3,8

0,1 16,5±ЬЗ 60±3,7

Пример 1. Приготавливают питательную среду для получения

-маннаназы из Bacillus subtilis G-78 в ферментерах объемом

1,5 м с коэффициентом наполнения 0,5. 59 В ферментер заливают 300 л подогретой до водопроводной воды, при перемешивании последовательно jзагружают 42 кг осахаренного картофельного крахмала, 7,5 кг муки из семян люцерны, 1,95 кг №4)504, 2,25к Ц5О, 0,75 кг N&iS04-5Hc 0 и 0,15 кг MgSQij. Стерилизуют 30 мин при . После стерилизации охлаждают до . Отдельно в приготовленный чан заливают 120 л подогретой до 60 С воды и пр перемешивании добавляют 26 кг жидкого кукурузного экстракта и 0,15 кг CaClQ, перекачивают в сателлит и стерилизуют в сателлите 5 мин при 135°С. После стерилизации охлаждают до 5°С и стерильным воздухом передавливают в ферментер. Отдельно в при готовительный чан заливают 120 л подогретой до водопроводной воды и в ней растворяют 3,6 кг NajJiPO и 0,5 кг ЫаШ, перекачивают в сателлит и стерилизуют 30 мин при .После стерилизации охлаждают до и стерильным воздухом передавливают в ферментер. Стерильную питательную среду охлаждают до и засевают культурой Bacillus subtilis G-78, рН при посеве 6,8-7,2. В течение первых двух часов температура падает до 37С и поддерживается постоянной во время всей ферментации. Расход воздуха 55 до конца ферментации. Продолжительность ферментации 15 ч. Об окон чании ферментации судят по максимальному накоплению фермента fS-маннаназы культуральной жидкости. Для определения р)-маннаназной активности биомассу и остатки среды отделяют центрифугиро ванием. В надосадочной жидкости определяют Ь-маннаназную активность, которая составляет 550 Е/мл. f5-мaниaнaзнyю активность определяют по методу B.V.Melleary, Carbohydrate Research, 67. 213-221, 1978.За условную единицу активности принимают такое количество фермента, которое .дает увеличение оптической плотности при длине волны 590 нм на 0,1 после инкубации реакционной смеси, состоящей из 1,5 мл 0,%-нoгo субстрата и 0,5 мл ферментного раствора, при рН 5,8 за 30 мин. П р и м е р 2. Приготовление питательной среды и получение фермента |Ь-маннаназы производят как в примере 1, только вместо люцерновой муки в состав питательной среды включают .0,6% муки из корней эремуруса. (% Ман77наназная активность культуральной жидкости 550 Е/мл. Данные сравнительной характеристики ii-маинаназной активности культуРЫ Bacillus subtilis G-78 на известной и предлагаемой питательной среде, приведены в табл. 2. Время культивирования, ч |5 маннаназная активность куль1туральной жид кости, Е/мл Как видно из табл. 2 на предлагаемой среде штамм Bacillus subtilis 0-78 дает увеличение выхода фермента более, чем в 100 раз. Себестоимость целевого продукта в соответствии с увеличением выхода фермента снижается на такую же величину, т.е. около 100 раз. По предварительным подсчетам годовая экономическая эффективность при использовании предлагаемой среды, в производстве препаратов Ь-маннаназы в количестве, необходимом для удовлетворения потребностей винодельческой промышленности СССР (10 усл. т.) 68,5 тыс. руб. Формула изобретения Питательная среда для получения Л-маннаназы из Bacillus subtilis G-78, (Содержащая картофельный крахмал,жидкий кукурузный экстракт, двухзамещенный фосфорнокислый натрий, сернокислыи аммонии, сернокислый марганец пятиводный, сернокислый магний,сернокислый калий, хлористый кальций, гидроокись натрия и воду, отличающ а я с я тем, что, с целью увеличения активности и выхода целевого .продукта и снижения его себестоимости, она дополнительно содержит муку из семян люцерны или муку из корней эремуруса в качестве индуктора при следующем соотношении компонентов, мае. %: Картофельный крахмал5,5-5,7 Жидкий кукурузный экстракт 3,-3,( Двухзамещенный фосфорнокислый натрий О,5-0,5 Сернокислый аммоний 0,,28

Сернокислый марганец

пятиводный 0,09-0,11

Сернокислый магний О,019-.021i

0,29-0,31Сернокислый калий

0,019-0,021

Хлористый кальций

0,06-0,07

Гидроокись натрия

0,9-1,1

Мука из семян люцерны или мука из

О,«-0,6

корней эремуруса Остальное

Вода

Источники информации, ринятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР 7А0830, кл. С 12 D 13/10, 1378.