Питательная среда для выращивания продуцента @ - @ -амино- @ -капролактамгидролазы Советский патент 1984 года по МПК C12N1/16 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частнос ти к получению питательных сред для выращивания продуцентов внутриклеточ ного фермента L-ct-амино-б-капролактамгидролазы. Предлагаемая питательная среда может быть использована для 1пол5гчения биомассы продуцента аминолактамазы, применяемой для получения Ь-лизина хнмико-энзиматичесКИМ способом. Известны питательные среды для вы ращивания продуцентов аминолактамазы содержащие ПЬ-о6-амино- -капролактам (сокращенно DL-аминолактам), дрожже|Вой экстракт, пептон, а также глюкозу и солодовый экстракт Cl3 и С2j. Включение в состав .этих сред доро гостоящих компонентов - дрожжевого экстракта, пептона, солодового экстракта препятствует их промышленному применению. Лля выращивания продзщентов амино лактамазы наиболее широко применяется питательная среда, содержащая, г/л воды: глюкоза 10, L-аминолактам 50, дрожжевой экстракт 0,5 и неорганические соли - аммоний азотнокислый 3, калий фосфорнокислый однозамещеиный 1, магний сернокислый 0,5 и марганец хлористый 0,2 C3J. Однако ферментативная активность получаемой на этой среде биомассы сравнительно невысокая, среда содержит дорогостоящиекомпоненты (дрожже вой экстракт и L-аминокапролактам в большой концентрации), а также компо нент, имеющий пищевую ценность (глюкоза). Цель изобретения - повышение ферментативной активности биомассы и удешевление среды. Поставленная цель достигается тем что питательная среда для выращивани продуцента L-об-амино- -капролактамги ролазы, содегетсащая Ь-о6-амино- -капролактам и неорганические соли - однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, хлористый марганец дополнительно содержит глицерин и кукурузный экстракт при следздащем соотношении компонентов, г/л воды: Ь-сС-амино- -капролактам4-6. Глицерин17-23 Кукурузный экстракт 5,5-6,5 Однозамещенный фосфорнокислый калий0,8-1,2 Сернокислый магний (7-водный)0,4-0,6 Хлористый марганец (4-водный)0,15-0,25 Сущность изобретения заключается в том, что глицерин и кукурузный экстракт в предлагаемой среде, являясь источником питания, одновременно необходимы для другого назначения экономического и эффективного получения Ь-оС-амино- -капролактамгидролазы в клетках дрожжей, т.е. их использование .приводит к исключению нежелательного явления катаболитной репрессии, значительного уменьшения количества индуктора биосинтеза и увеличению скорости образования фермента. Глицерин, будучи эквивалентным глюкозе как источник углерода, одновременно исключает влияние на биосинтез Ь-с -амино- -капролактамгидролазы нежелательного явления катаболитной репрессии и тем самым позволяет значительно уменьшить концентрацию L-аминокапролактама в среде, не понижая ферментативной активности биомассы. Таким образом, глицерин, проявляя свойства как источник питания, в случае культивирования продуцента индуци- бельного фермента Ъ-Х-амино- -кап- ролактамгидролазы существенно изменяет состав компонентов среды с созданием положительного результата. .Кзгкурузный экстракт по своей питательной ценности можно.считать эквивалентным дрожжевому экстракту. Однако они существенно различаются по влиянию на удельную скорость образования L-o -амино-б-капролактамгидролазы в клетках. При выращивании Сгурtococcus зр. 59 на среде с глицерином, аминокапролактамом, фосфатами и микроэлементами с содержанием дрожжевого или кукурузного экстракта- по 0,4%, удельная скорость роста в экспоненциальной фазе 0,40 и 0,35 Ч соответственно, а удельная скорость образования целевого фермента 0,08 ч в случае дрожжевого экстракта и 0,33 ч в случае кукурузного экстракта. Значительное (около 4 раза) увеличение удельной скорости биосинтеза при практически одинаковой скорости ipocTa является отличительным признаком кукурузного экстракта при вьфащиваниИ продуцента Ь-о6-амино- -капролактамгидролазы, приводящим к сверхсуммарному результату - повышению ферментативной активности продуцента

более чем в 2 раза. Такой эффект кукурузного экстракта объясняется отсутствием в нем репрессирующих биосинтез соединений, например L-лизина, действующего, вероятно, по механизму репрессии продуктом метаболизма.

Для получения питательной среды компоненты (кроме фосфорнокислого калйя растворяют в воде, прибавляют 10%-нЫй раствор NaOH до 7,0 и стерилизуют 30 мин при . Раствор фосфорнокислого калия готовят и стерилизуют отдельно. На предлагаемой питательной среде целесообразно вырапдивать культуру Cryptococcus species 5 являющуюся продуцентом аминолактамазы.

Пример 1. Выращивание продуцента аминолактамазы в колбах. .

Для выращивания продуцента аминолактамазы Cryptococcus cpecies 59 готовят питательную среду следующего состава, г/л воды:

L-аминолактам5

Глицерин20

Кукурузньй экстракт 6 КН2Р04- 1

MgSO -THgO0,5

MnClgAH O .0,2

Доводят рН питательной среды до 7,0 10%-ным раствором NaOH и стерилизуют 30 мин при 120с. Раствор стерилизуют отдельно и прибавляют в питательную среду перед заСевом. Питательную среду разливают в качалочные колбы емкостью 750 мл, объем среды в колбе 100 мл.

Культуру Cryptococcus species 59 обновляют, выращивая в чашках Петри на агаризованной среде того же состава, в течение 48 ч при 30 ч. Для приготовления посевного материала культуру вносят в качалочную колбу со средой и инкубируют 14 ч на качалке при частоте 200 об/мин и температуре . Полученный посевной материал .засевают в качалочные колбы со средой, используя 2,4 мг культуры на 100 ып среды. Вырапщвают на качал ке при частоте 200 р.б/мин, температуре в 18 ч. Затем биомассу отделяют центрифугированием м щ)и 4500 g, промывают дважды водой н лиофилизируют.

Для определения аминолактамазной активности микробныхс клеток в. смон ткрованную на магнитной мешашке и

термостатируемую при 50С ячейку приливают 3 мл 0,1 М раствора L-аминолактама (рН 8,0) при 50С и вносят точно взвешенное количество (3-5 мг в зависимости от активности) лирфилизованных клеток продуцента. Смесь перемешивают несколько минут, после чего берут контрольную пробу объемом 0,01 мл дляопределения фоновой концентрации продукта реакции гидролиза аминолактама - лизина. После взятия контрольной пробы смесь перемешивают ровно 30 мин. Реакцию останавливают прибавлением 0,5 мл 2,5 н. НС1. Затем из реакционной смеси берут 3 пробы по 0,01 мл, наносят на хроматографическую бумагу и определяют содержание лизина спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность окрашенного продукта реакции лизина с фурфуролом по методу M.Patthy, A.Patthy.

Активность аминолактамазы рассчитывают по формуле

ЛВ-У 1000,

А продукта/мин

на 1 г клеток, где D - разность оптической плотности исследуемой и контрольной проб;

V - объем реакционной смеси в ячейке (после octaнoвки реакции), мл; Е - молярньй коэффициент экстинкции;.

At - время реакции, мину g - сухой вес клеток, содержа,щихся в реакционной ячейке, г.

. Для определения активности исследуемой партии клеток ставят параллелно три реакции ферментативного гидролиза аминолактама и рассчитывают среднее арифметическое.

Пример 2. Выращивание продуцента аминолактамазы в ферментере.

Используют лабораторный ферментер типа Биолафнтт емкостью 20 л. Подготовку питательной среды, обновление культуры и приготовление посевного материала проводят аналогично как в примере 1. .

Посевной материал засевают в ферментер, используя 0,5 г культуры на 10л среды. Выращивают при перемешивании 350 об/мин, температуре 30°С, аэрации 8-10 л/мин, в течение 18 ч. Биомассу охлаждают до +4°С, отделяют центрифигурированием при 4500 g, промьшают дважды водой и лиофилизируют. В табл. 1 приведены результаты выращивания продуцента амиролактамаСпособ выращивания Количество опытов В колбах10 В ферментере5 Основные технико-экономические показатели питательных сред для выПоказателиПСтоимость компонентов питательной среды (кроме воды), руб/мз Удельная ферментативная: активность биомассы, мкмoль/мин г Прото зы Cryptococcus species 59 (доверительный интервал с доверительной вероятностью 0,95) в колбах и в ферментере. Таблица1 Ферментативная Выход биомассы, активностьjг/л МКМОЛЬ/МИНг г 7121642,5 + 0,4 730t585,0 ±0,5 ращивания аминолактамазы представлены в табл. 2. Т а б л и ц а 2 тательная среда ип (в колбах) Предлагаемая в колбах в ферментере 1064152 152 320712 730

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ BbffAВДВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА Ь-Л-АМИНО- -КАПРОЛАКТАМГИДРОПАЗЫ, содержащая LамиHo-g-капролактам и неорганические соли - однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, хлористый марганец, отличающаяся тем, что, с целью повышения ферментативной активности биомассы и удешевления среда, она дополнительно содержит глицерин и кукурузный экстракт при следующем соотношении компонентов, г/л воды: N L-ct-амино-Е-капролактам4,5-5,5 Глицерин17-23 Кукурузный экстракт,5,5-6,5 Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,8-1,2 Сернокислый магний

Как следует из приведенных данных, предлагаемая питательная среда по сравнению с прототипом дешевле в 7 раз, удельная ферментативная актив-40 ность биомассы возрастает в 2,2 раза, кроме того, не используются компоненты, имеющие пищевую ценность, что

особенно важно при промьшленном применении.

При годойом объеме ферментации аминолактй азы в 500 м экономический эффект составит 456 тыс. руб. за сч(лт снижения расходов на питательную среду.