Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS VaR.теNевRIоNSIS для производства инсектицидного препарата против насекомых СоLеортеRа Spp. Советский патент 1988 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

4

J

СХ) ;О

ел

Изобретение относится к сельско- Хоэяйственндй микробиологии, в уаст- ности к производству инсектицидных Препаратов, и касается штамма бактерий, с помощью которого получают инсектицидный препарат. Цель изрбре- тения - получение нового штамма бактерий патотипа С, позволяющего получить инсектицидный пр-епарат против Col.eoptera. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. tenebrionis депонирован в коллекции ФРГ под № DSM 2803. Инсектицидный препарат, полученный на основе указанного штамма, предназначен для уничтожения ольхового листоеда и картофельного жука. Титр спор в препарате составляет 3 « -«Ю спор/МП, LC JP составляет 5 спор/мл при опрыскивании Lj-личинок Leptinotarsa deumlimata, 1 табл. СУ)

см

Изобретение OT IOCHTCH к сельско- , хозяйственной микробиологии, в частности к ттроизводству инсектицидных препаратов, и касается штамма бакте™ рий, с помощью которого получают инсектицидный препарат.

Цель изобретения получение нового ттатла патотипа С, позволяющего получить инсектицидный препарат про- тив Coleoptera spp.

Штамм Bacillus thuringiensis varo tenebrionis патотип С выделен из бо™ льных личинок мучного хрущака (Тепе- ; brio molitor L), депонирован в кол- ; лекции ФРГ под номером DSM 2803,

Штамм амеет следующие культураль- но-морфологические признаки.

Вегетативная клетка имеет зкгутики. Палочки размером около 1,0x4 - 8 мм Граммпрлоясительиые. Клетка споры содержит наряду с субтёрминальными эл липсоидальными спорами (0,8x1,4 - . 1,6 мм) пг-распоровый кристалл плоской пластинчатой формы и с очертаниями .параллелограмма, ромба или квадрата (ок. 0,8-1,5 мкм длины кромок),

При выЕ ащивании штамма в течение 24 ч при на стерильной среде (ОХ01Д СМ-З), содержащей, г/л

Мясной экстракт Lab Lemco 1,0 Дрожжевой экстракт 2,0 Пептон5,0

NaCli.

Агар15,0

рН .7,4

образуются круглые беловатые колонии диаметром около 5 мм, шероховатые с неровными краями. Спорообразование и образование параспоровых кристаллов происходит приблизительно через 48 ч

При культивировании штамма на кальций-казеинатном агаре (MERCK 5409 состава, г/л

Мясной экстракт Merck 3,0 Пептон. 5,00

Казеин по Hainmarsten 2,50 NaCl, 5эОО

0,15 13,50

ВодаОстально

с добавлением сухого обезжиренного молока 5,0 г на 1 л среды, имеющей рН 7,0, при указанных условиях обра зуются круглые беловатые бактериальные колонии, вокруг которых имеются прозрачные ореолы (протеиназа-положи- тельная). Эбразование спор и параСа(ОН); Агар

O

5

0 5

0

5

0

5

„

0

споровых кристаллов происходит примерно через 48 ч.

На селективном агаре для Bacillus cereus (ОХ01Д 617), содержащем, г/л: Пептон1,00

Маннитол10,00

NaCl2,00MgS04-0,10

40,25

Na-пировиноградная кислота10,00

Бромтимоловый

голубойо,12

АгарЦ 500

ВодаДо 1 л

при рН 7,.2, с добавлением яичного желтка, (стерильно) 25,00 мл/л, через 24 ч инкубации при образуются колонии, окрашенные в голубоватый цвет (маннитол-отрицательный), что характерно для бактерий Bacillus се- reus/B, thuringiensis. Однако в про- тивопол ожность В.- ce reus .и также другим многим бактериям Bacillus thurin giensis - вокруг бактериальных колоний истамм В, thuringiensis var. tenebrions DSM 2803 не наблюдается никакого осажденного ореола (-лецити- наза-отрицательная). Спорообразование и образование параспоровых кристаллов происходят приблизительно через 48 ч, ,

Физиолого-биохимические признаки, Факультативный анаэроб, но споруг, ляция осуществляется строго в аэроб- ных условиях. Оптимальная температура роста вегетативных клеток составляет 25-30 С. Автоклавирование в течение 15 мин при (соотнет- ственно 1 бар избыточного давления) полностью инактивирует споры и кри- cтaJшичecкий токсин. Ультрафиолето- вое облучение при 254 нм инактивирует споры при соответствующей дозе, но : не кристаллический токсин, ;

Отношение к источнику углерода: из глюкозы, манноз ы и сахарозы образует кислоты и аустил метилкарбанал, но не, газ 5 не усваивает лактозу, целлобиозу, салицин, арабинозу, ксилозу и манниТо Гидролизует эскулин и крахм Л,

Отношение к источнику азота; как ед1 нственный источник азота не использует сернокислый аммоний. Для роста требует аминокислоты такие, как глутаминовую кислоту, 0,3%-ную). Однако особые факторы роста не требует.

Образует каталазу, нитратредукта- зу и протеиназу. 1е образует лизин- декарбонкснлазу,- фенилаланин, уреазу и лецитиназу,.

Серологическая характеристика штамма DSM 2803 (соответственно схема

Токсин кодирован геном, содержащимся в плазмиде. Токсин образуется также в аспорогенных мутантах, получаемых обработкой зтилметансульфона- том. Способность к образованию токсина можно перенести путем переноса плазмида или гена на другие разновидности Bacillus thuringiensis или

серотипизирования для В, thuringiensip|o другие бактериальные системы. Инсекпо de BARIACSBONNEPOI для Н-антигег- нов или SEKIJIMA 4ONO для О-антиге. нов):

Н-серотип 8а8Ь

0-серотип IX.15

Маркерным признаком штамма является DSM 2803 (антибиограмма), задержка роста следуюп4ими антибиотиками: эрит- роми1дином, налидиксиновой кислотой нитрофурантоином и тетрациклином.

Рост штамма не подавляется ампициллином, колистином MS, Ко-тримок- салом, пенициллином G, метициллином

и сульфадиазином.

Пример . парат получают следующим образом.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var tenebrions DSM 2803 культивируют в колбах Эрлейнмейера

тицидное действие основано на присутствии закодированного в плазмиде токсина.

Для применения в качестве инсектицида Bacillus thuringiensis var. tenebrionsis или получаемый из них инсектицидный препарат.или токсин смешивают. известным способом с обычными добавками (наполнителями, при- 20 липательныи добавками, смачивающими средствами и т.д.) и переводятв удоб-. ную для применения форму. Инсектицид такого состава можно применять в виде порошка, суспензии, гранулята и т.п.

Инсектицидный пре- 25 Предпочтительно применять очищенную

спорулированную культязу в виде суспензии с добавкой смачивающего средства, например в виде суспензии с добавкой смачивающего средства, наприобъемом 250 т, содержащей 50 ма ере-до мер, 0,1% Citowet (BASF). На гектар ды, включающей, %; дрожжевой экстракт обрабатываемого поля разливают 10, предпочтительно 10 -10 спор и эквивалентное количество токсичных кристаллов.

Действие штамма на ; личинки

0,5, триптон 0,5, глико за 0,1, 0,08, имеющей рН 7,0, при 25-30 С до образования спор. Затем биомассу отделяют центрифугированием и промывают водой или бз ерным раствором. Титр спор в препарате составляет 3 10 спор/мл. LCj5-5 -10 спор/мл для L личинок Leptino tarsa deumeimata.

Инсектицидным активным началом предлагаемого штамма является кристаллический токсин. Кристаллическую массу можно вьщелить, отделяя и очищая кристаллы от остатков клеток и спор после лизиса спорангиев, с помощью, например, метода градиента плотности.

Определен молекулярный вес с помощью электрофореза SOS-полиакрила- мида э геле методом Леммли. Найдены две основные полосы ок. 6500pOD и 70000D. Меньшие полосы меньшей интенсивности находились, в пределах 20000-400000.

С помощью токсина можно получить антитела, которые в иммунодиффузион- ном тесте Оучтерлони (Ouchterlony) не показывают перекрестной реакции с другими токсинами патотипа А или В.

35

жесткокрылых осз ществляется по схеме,, известной по патотнпу А: в стечение нескольких часов происходит прекращение питания и через несколько дней

4Q наступает смерть в зависимости от дозы. Токсичное действие основано на том, что ацителий средней кишки повреждается растворенньм в кишечном соке кристаллическим токсином. Поид врежденные клетки кишок насекомых отделяют одна от другой от базальной мембраны и дрейфуют в просвет кишечника. Вследствие нарушения кишечного барьера бактериальные клетки могут проникать в гемоцоэль и завершить в нем процесс дезинтеграции септицемией.

Новый инсектицид (патотип С) показывает избирательное инсектицидное действие против Coleoptera, например, против ольхового листоеда или картофельного жука. На личинок действие значительно сильнее, чем на взрослых насекомых. Действие не наб50

55

Токсин кодирован геном, содержащимся в плазмиде. Токсин образуется также в аспорогенных мутантах, получаемых обработкой зтилметансульфона- том. Способность к образованию токсина можно перенести путем переноса плазмида или гена на другие разновидности Bacillus thuringiensis или

другие бактериальные системы. ИнсекДействие штамма на ; личинки

35

жесткокрылых осз ществляется по схеме,, известной по патотнпу А: в стечение нескольких часов происходит прекращение питания и через несколько дней

4Q наступает смерть в зависимости от дозы. Токсичное действие основано на том, что ацителий средней кишки повреждается растворенньм в кишечном соке кристаллическим токсином. Поид врежденные клетки кишок насекомых отделяют одна от другой от базальной мембраны и дрейфуют в просвет кишечника. Вследствие нарушения кишечного барьера бактериальные клетки могут проникать в гемоцоэль и завершить в нем процесс дезинтеграции септицемией.

Новый инсектицид (патотип С) показывает избирательное инсектицидное действие против Coleoptera, например, против ольхового листоеда или картофельного жука. На личинок действие значительно сильнее, чем на взрослых насекомых. Действие не наб50

55

людалось на Lepidoptera, HangtHMep, мучном хрущаке (Ephestia kShniella Zell), капустной моли (Plutella хуФормула изобретения

lostella L.) и на Dipteraj например

, 5

Штамм бактерий Bacillus thuringi- ensis var. tenebrionis DSM ( 2803

мошке желтой лихорадки (Aedes aegypbi для производства инсектицидного преL.). В таблице приведены результаты

биотестов.

парата против насекомых Coleoptera. spp.

Токсичное действие полученного инсектицида на различные насекомые

10 /см

10 у см . 2,5x10 /см

4x10 /см

лихорадки

1/4489956

Формула изобретения

+

+

5x107 см